基于细胞的生物反应器是评估分子在动态条件下吸收情况的重要工具，能够模拟相似的生理流动、运输和生物屏障。它们使得能够进行吸收和代谢研究，从而获得非常具有预测性的体内条件数据。在本文中，提出了一种新的动态模型，用于评估不同蔬菜食品次生代谢物的肠道吸收和毒性，通过使用 LiveFlow® 生物反应器来实现。选择了不同的食品次生代谢物，如咖啡酸、奎宁酸、迷迭香酸、槲皮素和芦丁，它们属于多酚类。目的是研究它们在肠道中的不同吸收情况，以验证这种新系统作为替代策略或比传统培养系统更先进方法的优势，用于吸收筛选和测试。通过 RP-HPLC-DAD 对分子吸收和潜在代谢物的生成进行了评估。这种新型动态平台代表了一种极具前景的体外实验方法，它能够提供比传统静态体外实验方法更多的信息，并且至少在初步实验中，它是一种优于动物模型的高效替代方案。
️ 一、介绍
消化过程可改变化合物的生物活性，从而影响其生物可及性和生物利用度。因此，模拟胃肠道过程对预测其体内潜在效应具有重要作用。为模拟生理吸收过程，体外消化模型因其对不同食物成分体内条件的预测性而成为极具前景的研究手段。
静态方法（非细胞或细胞培养平台）因能快速经济地获得结果，被广泛用于监测不同化合物的消化率、生物可及性、生物利用度及生物活性。虽然这些方法能模拟胃肠道液体（pH值、盐分及酶浓度）和消化时间等条件，但缺少机械运动（蠕动、动态循环和被动扩散）和动态参数，无法提供生化参数信息。另一个关键问题在于文献中提出的静态消化方案过于繁杂，导致不同实验室的研究结果难以比较。
研究人员通过聚集40余个国家（欧洲国家、美国、加拿大等）近500名科研人员的国际合作，制定了静态消化标准流程（COST action InfoGest）。该方案及其改进版（InfoGest 2.0）致力于建立国际网络，推动包含口腔、胃和小肠十二指肠三阶段的标准非细胞食物消化方法的应用，实现体内胃肠道消化的预测。部分学者通过增加结肠阶段对此模型进行拓展，突显结肠酶、微生物发酵对某些分子生物利用度/生物激活的作用，以及其在微生物群研究中的价值。当前，国际公认消化方案的实施及相关改进，使建立针对特定人群（从婴幼儿到老年人）或病理胃肠道状况的模型成为可能。
为更快速预测肠道吸收，可通过仅采用基于肠道细胞的培养环节简化消化流程，该环节还可与上述非细胞静态方法结合以实现更完整的消化过程。多年来，人类结肠癌细胞（如Caco-2和HT-29）作为常规模型被广泛用于肠道细胞运输、摄取及黏液层分泌研究。这些细胞形成的上皮单层能模拟肠道结构与功能，具有自发性肠细胞样分化能力和刷状缘水解活性。尽管此类细胞系的渗透性低于体内实际水平，但其仍是研究分子吸收极具潜力的手段。
与静态非细胞模型和静态培养系统相比，动态条件的设置为模拟更接近生理的真实环境提供了重要突破。此外，动态模型可成为动物实验的有效替代方案，至少在初步研究中展现优势。然而，动态模型验证的复杂性仍是当前亟待解决的难题。近年开发的胃肠动态模型（TIM）、胃部动态模拟系统（HGS，又称研究人员模型）和动态胃部模型（DGM）等动态系统，通过配备多腔室、泵体、连接阀和过滤装置，能复现蠕动运动、pH值变化及渐进式分泌过程。
当前微型化趋势推动微流控装置（芯片）和毫流控平台的应用拓展。这类设备主要作为提取或合成反应器使用，但作为细胞培养平台时，也为快速检测化合物吸收与生物活性（治疗效果及毒性）提供创新解决方案。其通过模拟切向流等类生理流动，可显著提升传统静态Caco-2细胞模型的渗透性，进而优化肠道吸收与生物活性研究。
近年来，毫流控系统因较芯片更易制造且成本更低而备受关注，其复现生物屏障及流体体积/混合效应的能力与体内微环境高度相似。此外，这些系统在研究化合物与细胞相互作用时展现出独特价值。
前期研究中，我们采用商用毫流控生物反应器LiveFlow®搭建了多器官细胞动态平台，用于食物分子/副产物的胃肠道消化研究。本实验聚焦动态培养条件下Caco-2细胞的肠道吸收阶段，旨在构建能阐明不同次生代谢物吸收机制的筛选平台。通过测试多酚酸（咖啡酸、奎宁酸、迷迭香酸）和黄酮醇（槲皮素、芦丁），比较其肠道吸收差异并评估动态模拟的应用优势，相关结果与静态培养Caco-2细胞体系进行了对比。
️ 二、材料与方法
️01.试剂与化学品
迷迭香酸购自XXX，咖啡酸、奎宁酸、槲皮素、芦丁（图1）及HPLC-MS级有机溶剂由XXX提供。
图1. 测试化合物分子结构：咖啡酸(a)、奎宁酸(b)、迷迭香酸(c)、槲皮素(d)、芦丁(e)。
基础培养基、胎牛血清、谷氨酰胺-青霉素-链霉素混合溶液、聚赖氨酸溶液及刃天青细胞毒性检测试剂盒均购自XXX。Caco-2细胞由XXX提供。细胞增殖检测试剂由XXX供应。实验用水经超纯水系统制备。
️东莞市富临塑胶原料有限公司是IVTech srl中国独家代理商，为中国客户提供3D细胞培养产品:LiveFlow 蠕动泵、LivePa 环境控制单元、LiveBox2 生物反应器。
️02.样品制备
标准品溶液（1或2 mg/mL）使用液相级水（奎宁酸）或乙醇（咖啡酸、迷迭香酸、芦丁、槲皮素）配制，实验前用培养基稀释至0.1 mg/mL。
️03.动态生物反应器构建
LiveFlow®系统购自IVTech Srl，配套LB2双腔室流动培养装置（含顶室与基底室）。该装置可模拟肠道膜等生理屏障，实现动态细胞培养互联。
实验采用LB2装置与Caco-2细胞共培养体系。细胞接种于可渗透PET膜（孔径0.45 μm）后，调整装置产生切向流（见图2）。流速设定150 μL/min，预平衡48小时后加入多酚溶液（0.1 mg/mL）循环作用24小时。将接触细胞前的分子浓度记为t0基线值，通过RP-HPLC-DAD监测流动装置中样本在1、2、4、6、24小时的胞外浓度变化。所有样品经XXX提供的再生纤维素膜滤器（孔径0.2 μm）过滤后进行色谱分析，实验重复六次。
图2. 本实验采用的LiveFlow®生物反应器
️04.细胞培养与活性检测
为确定动态实验条件参数，通过MTS法测试了各化合物在0.02、0.1、0.2 mg/mL三个浓度下的细胞毒性。Caco-2细胞按标准方法培养并接种至96孔板（密度5000 cells/cm²），分别加入不同浓度测试液。孵育6/24小时后添加显色剂，于450 nm波长读取吸光度，实验设置8复孔且独立重复六次。动态实验中，细胞以相同密度接种至毫流控腔室并处理对应时长。
️05.色谱分析与方法验证
采用液相色谱系统进行样品检测，色谱柱组合为Gemini C-18柱与XSelect HSS T3保护柱（流速0.3 mL/min），流动相为0.1%甲酸水溶液/甲醇混合体系，洗脱比例依待测物调整：咖啡酸/奎宁酸65:35，迷迭香酸55:45，槲皮素/芦丁35:65。检测波长分别设定为325 nm（酸类）与360 nm（黄酮类），所有样本均三重分析。
方法学验证显示：各化合物在0.02–0.2 mg/mL范围内线性良好（R²＞0.99），检测限0.002–0.004 mg/mL，定量限0.01–0.02 mg/mL。日内/日间准确度92.10–103.85%，精密度＜2.0%，符合国际技术要求规范。
️06.统计分析
所有实验均执行六次独立重复并计算均值与标准偏差，显著性判定标准为p≤0.05（方差分析）。数据分析采用XXX电子表格软件完成。
️ 三、结果与讨论
选取咖啡酸、奎宁酸、迷迭香酸、槲皮素及芦丁（图1）作为研究对象，源于其作为膳食多酚的显著生物活性（抗氧化、抗炎特性及肠道环境调节作用）。这些化合物广泛分布于蔬果饮品中：咖啡酸与奎宁酸富集于咖啡豆，迷迭香酸常见于唇形科草本，而槲皮素/芦丁多存在于葡萄、杏、苹果等水果。尽管天然含量丰富，但其肠道低吸收率显著影响生物效能。
为此，研究采用动态生物反应器中PET膜培养的Caco-2细胞探究此类化合物的吸收机制，并与文献静态模型数据进行对比。实验以0.1 mg/mL浓度、150 μL/min流速处理细胞6-24小时，于不同时间节点（1、2、4、6、24 h）取样并通过RP-HPLC-DAD检测吸收趋势。阿尔玛蓝法检测显示动态处理6-24小时未见细胞毒性。
测试浓度（0.1 mg/mL）根据每日预估摄入量及前期细胞活性实验结果确定。
️01.测试分子对Caco-2细胞活性的影响
为确定吸收实验的安全浓度，首先通过MTS法评估了0.02、0.1和0.2 mg/mL三个浓度梯度。结果显示，所有测试分子在不同浓度下均未表现细胞毒性作用（6小时与24小时孵育的细胞活性百分比与对照组无显著差异）。基于此，选定中间浓度0.1 mg/mL（图3）用于吸收研究，该浓度在确保数据可靠性的前提下有效规避细胞活性干扰。
图3. Caco-2细胞暴露于0.1 mg/mL测试化合物6小时与24小时的活性百分比
️02.动态体外肠道模型吸收评估
膳食多酚普遍存在肠道代谢率低、吸收效率差等特点，这与其生物活性弱化密切相关。值得关注的是，这类化合物在胃酸环境下表现稳定。其稳定性和生物可及性受化学结构及食物基质组成差异显著影响，此外消化模型的选用亦会导致文献中吸收数据波动。
本研究通过动态系统模拟关键肠道步骤（图2），选用Caco-2细胞——研究上皮屏障功能及转运蛋白（如P-糖蛋白、多药耐药蛋白）的经典模型——搭建实验平台。为验证培养于毫流控腔室的Caco-2上皮屏障功能性，实验全程监测跨膜电阻（TEER）以评估细胞间连接完整性。使用ERS-2型电阻仪测得单层细胞初始TEER值为250 Ω·cm²，与文献报道的紧密连接完整性标准一致。
通过定时采集循环培养基样本并采用优化流动相的RP-HPLC-DAD法分析，动态评估分子吸收特性。以初始浓度（t0=0.1 mg/mL）为100%未吸收基准，计算各时间节点（1-24 h）胞外液残留百分比，具体结果见表1。
表1. 各化合物在不同时间点的未吸收百分比。
色谱分析显示监测期内未出现代谢物特征峰，所有定量检测均基于目标分子原始峰（图S1-S4）。选定6小时为关键观测节点（对应食物小肠至结肠迁移常规时长），24小时为完整消化周期表征点。
奎宁酸（QA）（图1a）接触1小时后即实现完全吸收（色谱图未见残留峰）。值得注意的是，t0样本分析同样未检出特征峰，表明QA行为与细胞接触无关。文献报道其高渗透性与低吸收率悖论可能与主动外排机制相关，Caco-2细胞低浓度（≥10 µM）实验证实该机制具有浓度依赖性。推测QA可能通过与培养基组分形成稳定复合物（尤其涉及α-羟基羧酸基团），导致检测信号屏蔽——这种现象不影响溶解特性，但干扰现有色谱方法定量。
咖啡酸（CA）（图1b）作为低渗透性多酚代表，文献记载其肠道吸收率为0–20%（首小时）。本研究数据显示：接触4小时/6小时后培养基中CA残留分别为91.48%±4.92与86.14%±7.15，吸收率约10–15%（表1），验证其弱吸收特性。其转运机制存在单羧酸转运体主动运输与细胞旁路扩散两种假说，静态培养与动物模型均支持该结论。
迷迭香酸（RA）（图1c）虽被归类为低渗透性多酚，但其生物可及性达50%。主要吸收路径为细胞旁路扩散，亦有研究推测存在主动运输机制。外排转运蛋白与紧密连接蛋白对其吸收起关键调控作用，动物实验证实其消化过程中代谢迅速。特别值得关注的是，该化合物在中性/碱性环境下呈现优异稳定性，体外肠道消化2小时保留率约78%（本研究2小时未吸收率86.23%±4.05）。动态数据显示其吸收呈时间依赖性：6小时吸收率约40%，24小时完成完全代谢。
槲皮素（QRC）与芦丁（RU）对胃肠道具有显著调控效应，其中QRC（图1d）可增强Caco-2单层细胞紧密连接稳定性。动态系统实验显示QRC接触4-6小时吸收率达50-60%，与文献报道的静态模型数据相符。其快速吸收特性与肠道内葡糖醛酸化代谢密切相关，24小时可完成完全代谢转化。
芦丁（图1e）作为低吸收黄酮代表，其生物可及性受浓度影响显著。本研究发现：接触6小时未吸收率90.74%±4.70，24小时仍维持86.85%±8.63，提示其渗透受限于Caco-2细胞膜屏障及外排转运机制（如P-糖蛋白介导）。静态模型研究亦证实该化合物表观渗透系数极低，与肠道屏障的低通透特性一致。
️ 四、结论
本研究证实毫流控系统中的细胞培养体系能有效模拟体内环境进行动态吸收研究。Caco-2细胞与生物反应器联用可明晰静态实验获得的生物可及性数据，为功能性食品成分筛选提供新策略。该平台模块化设计赋予其强大拓展性，未来可开发为实时监测分子吸收与生物活性的标准化工具。
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