多药耐药性仍是化疗治疗的障碍。P-糖蛋白（P-gp）是导致这一现象的蛋白质之一，已知其负责将治疗药物从细胞质中外排。目前，寻找能有效抑制P-gp活性的药物仍具挑战，但已有研究发现某些天然化合物具有这一潜力。其中，基于Caco-2细胞的体外研究表明，姜黄素对该蛋白具有抑制作用。为探究流体条件是否可调控姜黄素对P-gp活性的影响，我们通过IVTech srl开发的生物反应器系统，在静态和动态条件下研究了P-gp底物的摄取。实验分别采用生物反应器与Transwell培养的Caco-2细胞，通过罗丹明-123的基底侧转运量评估两种系统中的P-gp活性，并对比姜黄素提取物与合成芳甲氧基苯衍生物预处理对活性的抑制效果。结果表明：生物反应器中培养的细胞P-gp固有活性较低，且流动条件增强了天然与合成抑制剂的调控作用。本研究证实，采用更复杂且生理相关性更高的体外模型（如生物反应器）能更深入地揭示姜黄素等天然物质的治疗机制。
️ 一、背景
化疗仍是晚期和/或转移性肿瘤的首选治疗方案。遗憾的是，癌细胞已表现出对多种抗肿瘤药物的耐药能力，这种适应性常被称为"多效性耐药"或"多药耐药"（MDR）。与耐药性相关的细胞机制可在具有耐药表型的细胞中与药理学耐药同时或先后发生，具体表现为多种蛋白的激活。
参与多药耐药的膜糖蛋白（P-gp）属于质膜外排蛋白家族，其功能类似泵体，可将化疗药物等中性或弱碱性两亲性物质从细胞质中排出。实际上，P-gp多年来一直是克服多药耐药的主要药理学靶点。
在人类胃肠道中，P-gp高浓度存在于结肠和远端小肠表层柱状上皮细胞的顶膜区。当组织发生癌变时（如结直肠上皮癌变），其表达量会显著升高。尽管科研人员已尝试筛选具有"化疗增敏剂"或"MDR调节剂"功能的P-gp抑制剂，但这些策略迄今未取得实质性突破，且在临床试验中屡屡失败。早期通过钙通道阻滞剂和抗类固醇药物（第一代调节剂）调节P-gp的尝试，因这些化合物干扰多种酶系统而受挫；后续开发的第二代、第三代药物也因不可预测的药代动力学相互作用未通过临床验证。
近年来，研究人员转向从天然物质中探寻有效的P-gp抑制剂。已研究的化合物包括：黑胡椒（胡椒碱）、丹参（丹参酮）、甘草（甘草酸）、辣椒（辣椒素）、绿茶（表没食子儿茶素没食子酸酯）及姜黄（姜黄素）。
姜黄是研究最深入的植物提取物之一，其在静态体外模型中对肠道糖蛋白的作用已有较多探索。图1展示了姜黄素存在时P-gp泵活性的抑制情况。
图1. 姜黄素对P-糖蛋白（P-gp）活性的抑制作用：（A）P-gp将底物从细胞质中外排；（B）姜黄素分子在顶膜区抑制P-gp活性。
研究通过肠道单层细胞模型发现，姜黄素可下调肠道P-gp的表达与功能。具体而言，30 μM浓度的姜黄素可使罗丹明123（P-gp底物）在细胞内的蓄积量较对照组增加两倍，并减少顶膜区外排（降幅达30%）。研究人员通过对比姜黄与“Khamin oi”姜属植物根茎提取物，证实姜黄提取物以剂量依赖性方式抑制肠道P-gp活性并促进罗丹明123摄取。
️东莞市富临塑胶原料有限公司是IVTech srl中国独家代理商，为中国客户提供3D细胞培养产品:LiveFlow 蠕动泵、LivePa 环境控制单元、LiveBox2 生物反应器。
两项研究均采用Transwell系统培养的Caco-2细胞。该细胞可分化形成极性上皮单层，构成离子与小分子通行的物理及生化屏障，被广泛应用于制药领域以模拟小肠黏膜环境并预测口服药物吸收。
为探究流动条件对P-gp调控的影响，研究人员进一步在生物反应器中培养Caco-2细胞研究肠道P-gp抑制。所选系统整合了顶膜与基底膜双向流体腔室，能够更好地模拟肠道动态生理屏障。实验中通过对比Transwell（静态）与生物反应器系统，分析姜黄素提取物与合成芳甲氧基苯衍生物（APD，经[3H]-长春花碱转运抑制试验验证其对P-gp的IC50为0.19 μM）预处理后P-gp底物的顶膜外排差异。据文献报道，这是首次将该类装置应用于姜黄素介导的P-gp抑制研究。
️ 二、方法简述
研究通过预实验确定姜黄素的安全剂量，随后在Transwell与生物反应器中培养Caco-2细胞21天（定期监测跨上皮电阻TEER与阻抗TEEI），最终通过罗丹明-123（Rh-123）转运实验评估姜黄素提取物与合成化合物APD对P-gp活性的影响。图2为实验设计示意图。
图2. 实验设计示意图：（A）姜黄素细胞毒性预实验；（B）静态与动态体外模型的构建及21天培养后P-gp活性评估。
️01.细胞培养与传代
Caco-2细胞于含10%热灭活胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸及1%青链霉素的高糖杜尔贝科改良Eagle培养基中扩增培养，所用试剂均购自常规供应商。
实验采用IVTech srl生产的LB2型生物反应器，其顶膜腔与基底膜腔通过多孔聚酯膜（孔径0.45 µm）分隔，并通过流体管路连接独立培养基储液槽。流动由IVTech srl蠕动泵驱动，系统内置环形玻片支持活细胞成像。
将30-45代Caco-2细胞以25,000个/cm²密度接种于生物反应器及12孔Transwell板（孔径0.40 µm）。生物反应器顶膜腔与基底腔分别添加2 mL和1 mL培养基，Transwell体系对应添加500 μL和1 mL培养基。所有样本在37°C、5% CO₂环境下培养3周，静态组每3天换液。
动态培养7天后，顶膜与基底循环系统各充入10 mL培养基，以150 μL/min流速维持层流（膜表面剪切力约6×10⁻⁴ Pa，符合生理范围），每周更换半数培养基。
️02.姜黄提取物与APD化合物制备
姜黄提取物源自市售胶囊（含95%纯度姜黄素450 mg/粒），用DMSO配制成45 mg/mL储存液。APD化合物由合作单位提供，以汉克平衡盐溶液溶解为10 mM储存液。该衍生物通过长春花碱转运抑制实验验证对P-gp具有选择性抑制活性（IC₅₀=0.19 μM）。
️03.姜黄素毒性评估
通过测定不同浓度姜黄素处理前后细胞代谢活性，初步评估其毒性阈值以确定后续动态/静态对比实验的安全剂量。
Caco-2细胞接种于24孔板培养7天后，分别加入含梯度浓度姜黄素（11.25-90 µg/mL）的培养基（DMSO终浓度0.02%），37°C处理48小时，对照组仅含0.02% DMSO。
️04.细胞屏障监测与形态分析
通过光学显微镜定期观测Transwell与生物反应器中单层细胞形态，并测量跨上皮电阻（TEER）评估紧密连接完整性：
生物反应器：使用集成阻抗仪以40 Hz频率监测TEER
Transwell：采用电生理仪（12.5 Hz）配合叉式电极测量
最终TEER值经空白电阻校正后乘以膜表面积（1.2 cm²/1.8 cm²）计算得出。
同步在生物反应器中采集40-10,000 Hz频段阻抗谱（TEEI），通过扣除空白阻抗并计算单位面积值，精确定量单层屏障致密性。研究人员证实两种仪器测量结果具等效性。
️05.P-gp活性评估
培养第20天，所有样本经磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，按如下方案处理：
生物反应器：顶膜循环系统注入10 mL姜黄素溶液（50 µg/mL）
Transwell：顶膜腔直接添加0.5 mL姜黄素溶液
基底腔均补充新鲜培养基，流速维持150 µL/min，37°C孵育过夜。
处理后弃去溶液并用PBS清洗，随后基底腔注入含罗丹明-123（Rh-123，10 µM）的汉克平衡盐溶液。分别于0分钟和120分钟采集顶膜腔样本（100 µL/次），同步补充预温缓冲液，2小时后同步收集基底腔样本。使用酶标仪（激发波长485 nm/发射波长535 nm）定量Rh-123浓度。
实验设置三组对照：
阳性对照：顶膜腔替换为APD（100 µM）
阴性对照：未预处理细胞的基础活性检测
所有实验均在动态/静态模型中平行开展（n=6），具体流程详见图3。
图3. 研究P-gp活性的六个不同样本组示意图 在进行细胞研究前，预先在未种植细胞的Transwell小室和生物反应器中进行了相同转运实验。实验考虑了材料表面残留结合的Rh-123含量，并用此数值对细胞实验数据进行归一化处理。
️06. 数据分析
基于平面细胞培养模型中Rh-123从基底侧向顶侧的外排情况，分析姜黄素或APD对P-gp活性的影响。数学模型中，P-gp活性通过120分钟时顶侧和基底侧的Rh-123质量（µg）（分别为t1顶侧和t1基底）以及实验初始加载的Rh-123量（t0基底）进行计算。所有参数均经空白对照组（即无细胞体系）标准化后，整合入如下方程：
为评估物质处理（姜黄素 vs. APD）对蛋白质活性的抑制程度，研究人员采用以下方程：
统计数据分析采用双因素方差分析法，结合Tukey多重比较检验（显著性设定为p<0.05），使用GraphPad Prism软件完成。结果部分误差线表示标准偏差（n=6）。
️ 三、结果
️01.姜黄素毒性评估
通过将Caco-2细胞与不同浓度姜黄素共孵育评估其细胞毒性。细胞在24孔板中培养7天后，分别在使用不同姜黄素提取物孵育48小时前后，采用Alamar blue检测法测定细胞代谢活性。结果显示（图4A），45–11.25 µM浓度范围内的姜黄素溶液对细胞代谢活性无显著影响，仅在最高测试浓度90 µM时细胞代谢活性下降至约70%。50 µM姜黄素溶液处于无毒浓度范围，因此被用于后续P-gp活性调控实验。
图4. (A)不同浓度姜黄素孵育48小时后相对于0µM对照组的细胞活性；(B)生物反应器与Transwell小室中跨上皮电阻（TEER）的屏障监测；(C)生物反应器中不同时间点的跨上皮电阻抗（TEEI）；(D)未处理样本（阴性对照）的P-gp活性；(E)Transwell小室和生物反应器中姜黄素与芳甲氧基苯衍生物（APD）（阳性对照）对P-gp活性的调控作用。误差线表示标准偏差（n=6），* = p < 0.05，** = p < 0.01。
️02.细胞监测与形态分析
将Caco-2细胞接种至生物反应器与Transwell小室后，研究人员通过光学显微镜观测及TEER/TEEI测量，对其21天分化过程进行定期监测。如图5所示，细胞逐渐形成致密单层结构，10-12天后呈现分化细胞的特征。
图5. 培养第11天的生物反应器中Caco-2细胞单层。(A) 4倍放大；(B,C) 10倍放大（不同焦平面）。
通过TEER与TEEI分析进一步验证致密单层结构的形成。如图4B所示，培养过程中TEER持续升高，至第14天达到稳定值（Transwell小室约800 Ω·cm²，生物反应器约1000 Ω·cm²），并维持至第21天。此外，生物反应器中的TEEI趋势（图4C）表明，各时间点均存在完整的细胞层。
完成P-gp调控实验后，研究人员对细胞进行固定处理，并对肌动蛋白纤维及紧密连接蛋白occludin进行染色。运输实验期间单层结构保持完整，且细胞紧密连接未受破坏（通过occludin标记验证，图6B）。
图6. 生物反应器中与姜黄素共孵育并进行P-gp活性检测后的Caco-2细胞单层。（A）细胞核与肌动蛋白微丝荧光染色；（B）紧密连接蛋白occludin荧光染色。
️03. P-gp活性评估
通过检测Transwell小室与生物反应器中细胞基底侧向顶侧的Rh-123外排量，研究人员分析了P-gp活性，并评估姜黄素与APD（阳性对照）对其活性的调控作用。
统计数据显示：未使用抑制剂时，生物反应器中P-gp活性低于静态培养条件（图4D）；使用天然/合成抑制剂后，生物反应器中P-gp活性较Transwell小室进一步降低（图4E）。此外，无论在静态还是动态条件下，姜黄素对P-gp活性的抑制效果（静态平均抑制率98%，动态100%）均优于阳性对照（静态83%，动态92%），表明天然物质对Rh-123外排的调控作用强于选择性P-gp调节剂APD。
️ 四、讨论
初步毒性实验中，90µM姜黄素使Caco-2细胞代谢活性下降<20%，故选用50µM无毒浓度进行P-gp调控实验，该浓度范围与文献报道方案一致。
Caco-2细胞在Transwell小室与生物反应器中均可形成致密分化单层。值得注意的是，单层细胞并非平面扩展，而是形成类似肠道环境天然结构的穹顶状形态（如图5B,C所示）。两种培养体系的单层均经过约7天达到完全融合（TEER值>600 Ω·cm²），第14天和21天分别达到峰值（Transwell小室约800 Ω·cm²，生物反应器约1000 Ω·cm²，见图4B）。生物反应器中单层完整性通过TEEI检测进一步验证（图4C），其趋势符合典型RC电路特性：低频时电流经紧密连接旁细胞通路，高频时电流可穿透细胞层（跨细胞通路）。生物反应器中较高的TEER值表明流体条件可增强屏障完整性，这与研究人员的发现一致。
培养21天并通过渗透性测试后，occludin蛋白染色结果进一步证实紧密连接的存在。该膜表面跨膜蛋白可通过介导细胞间粘附作用调节小分子物质的膜间与旁细胞扩散。如图6所示，P-gp活性检测实验未对单层完整性与紧密性造成干扰。
通过Rh-123从基底侧向顶侧的外排量评估姜黄素对P-gp的作用。由于P-糖蛋白主要表达于细胞顶侧膜表面，顶侧Rh-123的累积量可反映其活性水平。
研究发现：姜黄素在静态模型中显著抑制P-gp活性，这与既往静态培养研究结论一致；而在模拟体内环境的生物反应器动态培养中，姜黄素抑制作用更为显著——这一现象此前在姜黄素治疗效应研究中尚未被报道。动态与静态实验结果共同印证了动物模型研究结论：姜黄素通过抑制P-gp活性影响抗癌药物的口服药代动力学。
对于合成调节剂APD，本研究使用剂量（100µM）虽高于文献报道的有效抑制浓度，但其对P-gp的抑制效果仍弱于姜黄素（图4E）。值得注意的是，姜黄素可能同时作用于Caco-2细胞中其他ATP结合盒（ABC）转运体（如MRP2、BCRP/ABCG2），而APD仅特异性靶向P-gp，这提示需进一步验证姜黄素对P-gp的选择性抑制作用。
本研究的核心创新在于揭示流体剪切力对细胞顶/基底侧P-gp活性调控的影响。数据显示：相比Transwell静态模型，生物反应器中培养的细胞Rh-123转运效率及P-gp外排活性显著降低（图4D,E），这凸显了生物反应器在Caco-2模型中的应用优势——传统单层模型可能高估P-gp介导的药物外排作用。
我们推测静态与动态条件下P-糖蛋白外排活性的差异可能与剪切力诱导的机械信号转导效应相关，该机制已知可调节P-糖蛋白活性。既往研究虽探讨过流体剪切力对P-糖蛋白表达的影响，但未涉及天然化合物对其活性的动态调控。根据文献报道的透膜参数，二维静态Caco-2培养模型中罗丹明的基底-顶侧转运量高于三维动态组织模型，但研究人员未对二维静态与二维动态条件进行比较。
另一方面，研究显示在空心纤维生物反应器中培养的Caco-2细胞P-糖蛋白表达上调，这可能与基质拓扑特性有关。类似地，灌注式生物反应器中基于脱细胞支架的肠道屏障多细胞模型相比单层Caco-2培养模型，P-糖蛋白表达及Rh-123外排量均有所增加。需注意的是，这些研究采用的生物反应器类型、基质材料、细胞来源及模型构建策略存在差异，可能导致P-糖蛋白活性观测结果的偏差——不同生化与机械信号的协同效应可能起关键作用。
值得注意的是，流体剪切力对P-糖蛋白活性的差异化调控不仅见于肠道模型。例如，研究人员发现内皮细胞在1 Pa剪切力下P-糖蛋白活性达到峰值，而在4 Pa时下降；而另一些研究提出相反观点，认为大鼠脑微动脉中高剪切力会下调P-糖蛋白表达。本研究中施加的剪切力低于上述范围，提示肠道细胞对低强度机械刺激具有高度敏感性，但需注意高剪切力效应与营养供给增强的耦合影响难以完全解耦。
值得关注的是，尽管生物反应器中细胞的基础P-糖蛋白活性较低，但APD与姜黄素对其活性的抑制效率更高。这表明流体环境不仅直接调控P-糖蛋白，还影响外源性调节剂的作用效能。这种矛盾现象可能与流体作用下底物（Rh-123）与蛋白的结合特性改变，或芳甲氧基苯衍生物及姜黄素的抑制机制变化有关。
️ 五、结论
本研究证实生理微环境的存在可影响外源性物质对P-糖蛋白（P-gp）的体外调控机制。实验结果表明，姜黄素在动态与静态模型中对该蛋白的抑制作用存在显著差异。天然物质的治疗潜力在药物开发与营养制剂领域具有重要价值，因此必须采用尽可能还原体内环境条件的体外模型进行研究。作为首项探讨动态培养体系下姜黄素-P-糖蛋白相互作用的研究，我们的工作表明：使用更先进的培养技术可为姜黄素等天然物质的治疗效应研究提供新维度认知。
️东莞市富临塑胶有限公司是Degrapol在中国的代理商，采购医用植入级亲水性可降解聚氨酯Degrapol，请立即联系富临塑胶！
公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810
