等温滴定量热法的工作原理

等温滴定量热法 (ITC) 是一种分析技术，通常被认为是分析分子间相互作用的黄金标准。它是一种滴定法，是一种用于定量化学分析的容量法，其中试剂溶液（滴定剂）与分析物或被滴定物溶液发生反应。

滴定在恒定的压力和温度下进行，这意味着单个 ITC 实验即可提供结合焓、平衡缔合常数和化学计量学的数据，从而可以计算结合熵和吉布斯能。因此，单个 ITC 实验可以直接获取与相互作用过程相关的关键热力学势——吉布斯能、焓和熵。

️研究结合相互作用的 ITC

ITC 符合实验技术的标准要求，旨在研究结合相互作用。ITC 直接测定恒压下反应过程中的热量 Q T，该热量与该过程相关的摩尔焓变 ΔH 成正比（以非配位状态为参考），以及形成的大分子-配体复合物的量：

（1）

其中 V 0为量热池的体积，[M] T为量热池中大分子的总浓度。第一个条件意味着相互作用焓（即复合物形成焓）不为零。第二个条件由第一个条件满足，因为 Q T与结合过程的进展成正比：

（2）

如果满足以下条件，则可以无模型的方式使用方程 1 和 2 来估算结合焓：

• 大分子达到完全饱和或 M L /M T接近于 1
• 适当减去参考背景热量
• 蛋白质浓度测定具有合理的准确度

️ITC的优势

• 在一次实验中完成基本的热力学表征（化学计量、结合常数和结合焓）
• 热量是一种通用信号，因此不需要报告标记（例如发色团、荧光团）
• 直接测定结合焓
• 无损技术
• 溶液中的相互作用
• 可以使用光学致密溶液或不寻常的系统（例如分散体、完整的细胞器或细胞）进行实验
• 速度相当快（从单次注射实验中的 0.25 小时/测定到传统滴定实验中的 2 小时/测定）。

️ITC的缺点

• 信号与结合焓成正比，非共价复合物可能表现出相当小的结合焓
• 热量是一种通用信号，每个过程都会对全球测量的热量产生贡献，因此由于结合作用，使得贡献的评估变得复杂
• 需要大量样本，尽管样本量已大幅减少
• 这是一种速度慢、通量低（0.25 - 2 小时/次测定）的技术，不适用于 HTS
• 动力学缓慢的过程可能会被忽视
• 持续测量结合亲和力的范围有限（传统滴定实验的结合常数为 104 - 10M -1
• 在此之前，无法获取结合相互作用的动力学信息

️基本平衡热力学

当具有单个结合位点的大分子和配体以一定的实验浓度混合时，可逆结合反应的程度，或大分子-配体复合物的浓度 [ML]，由平衡结合常数 Ka 给出：

（3）

其中 K d是复合物的平衡解离常数，[M] 和 [L] 分别是自由大分子和配体的浓度。这两个常数都与（标准）吉布斯结合能 ΔG 相关：

（4）

其中 T 是热力学或绝对温度，R 是气体常数。

结合常数越大，解离常数越小，结合吉布斯能越负，从而形成更强的复合物。

公式 3 得出大分子-配体复合物的摩尔分数与游离配体的浓度之间的众所周知的双曲线关系：

（5）

通过该方程，可以推导出形成的大分子-配体复合物的浓度，因此，只需将其乘以总蛋白质浓度和摩尔结合焓，即可轻松计算出与该复合物形成相关的热量。然而，在滴定实验中，游离配体的浓度是未知的，而控制浓度是大分子和配体的总浓度。因此，公式5不能用于滴定分析。

结合吉布斯能可分为焓贡献 ΔH 和熵贡献 TΔS：

（6）

特定相互作用的基本热力学结合曲线包含三个关键结合参数：吉布斯能（根据平衡结合常数K a计算）、结合焓和结合熵。将这三个热力学势结合起来，可以提供有关结合过程的基本且有价值的信息。

️结合热力学的直接测量

如前所述，单个 ITC 实验即可提供给定结合相互作用的完整基本热力学曲线。该实验方法包括以完全自动化的方式，将滴定剂（通常是配体）从注射器多次注射到池中的滴定剂溶液（通常是大分子）中，同时保持系统处于等压、准等温状态。

通过顺序注入配体，化学平衡会因配体注入引发的反应物浓度的增量变化而受到干扰，并且系统会经历几种组成不同的平衡状态，因为自由大分子和配体结合大分子之间的分配基于平衡（缔合或解离）常数以及大分子和配体的总浓度：

（7）

其中下标 i 表示滴定过程中的注射次数，每次注射后大分子和配体的总浓度为：

（8）

其中 [M] 0和 [L] 0分别是池中的初始大分子浓度和注射器中的配体浓度，v 是注射量，(1- v/V 0 ) 因子是在恒定体积下操作的量热池中发生的稀释。

由配体注入引发的两个连续状态之间的每次转变都与热量的吸收或释放有关，热量的吸收或释放与该注入引起的复合物浓度的变化和摩尔焓成比例：

（9)

ITC，是一种有限差分或增量技术。

图 1 显示了具有单个配体结合位点的大分子的典型量热滴定。

️图1.大分子与配体结合的量热滴定，其结合参数如下：K a = 10 6 M -1 , ΔH = -5 kcal/mol。上图：热分析图（维持量热仪中参比池和样品池之间温差为零所需的热功率），显示了每次配体注射对应的特征峰序列。下图：结合等温线（量热池中每个峰的归一化热量与摩尔比 [L] T /[M] T的关系）。上图插图：随着滴定的进行，量热池中自由大分子（空心方块）和大分子-配体复合物（实心方块）的摩尔分数的变化。下图插图：大分子-配体相互作用的热力学结合曲线；在这种情况下，焓和熵的贡献都有利于结合。可以清楚地观察到，最后一个峰的平均值不能很好地估计注入背景热量（所谓的“稀释热”）。

可以使用参数 N in 来标准化标称蛋白质浓度，以获得非分数 N 值（图 2），从而“滴定”蛋白质溶液。

️图 2.大分子浓度不确定性对量热滴定法估算结合参数的影响。（左图）使用标称浓度（注射器中配体为 230 pM，细胞中大分子为 29 pM）进行数据分析，得到 N 的分数值 (0.72 ± 0.01)。由于本例中配体浓度被认为相当准确，因此该分数值表明蛋白质浓度估算过量，误差为 28%。采用根据 N (21 µM) 标准化的蛋白质浓度，可以恢复预期的非分式 1:1 化学计量 (N ≈ 1)（右图）。由于仅修改了细胞浓度，因此结合常数和结合焓保持不变。如果修改注射器浓度，这两个参数也会发生变化。

为了在分析实验滴定中适当地应用公式 9，并获得结合参数的良好估计值，需要解决“稀释热”问题。

有三种方法可以消除这种非特定热效应的影响：

• 通过将配体稀释到缓冲液中并从配体-大分子滴定中减去产生的热量来进行控制实验；
• 对配体-大分子滴定中最后一次注射（接近大分子饱和度）产生的热量进行平均，并从数据中减去该值
• 在公式 9 中引入一个额外的可调参数 Qd，用于计算注入背景热量

第三种选择是首选，因为当存在大分子时，稀释实验不一定模拟注射背景效应。

ITC 可获取的定量信息

理论上，可以通过一次滴定确定平衡结合常数、结合焓和化学计量。

然而，该估计的一致性取决于结合亲和力和实验设置。可以设置一个无量纲参数 c，其中：

• 如果 1 < c < 10000，则可以同时精确确定三个结合参数
• 如果 c > 10000，则只能确定结合焓和化学计量
• 如果 c < 1，则只能确定平衡结合常数，因为结合焓和化学计量将相关

图 3 显示了基于 c 值的三种不同场景。

️图3.不同c值下的量热滴定：（左）c = 0.1，K a = 10 4 M -1；（中）c = 100，K a 10 7 M -1；（右）c = 100000，K a = 10 10 M -1。三种情况下：ΔH = -10 kcal/mol，[M] 0 = 10 pM，[L] 0 = 100 pM，V 0 = 0.2 mL，v = 2 pL。插图显示了滴定过程中大分子-配体复合物的摩尔分数（大分子饱和度）。显然，低c值的情况会出现问题：信噪比非常低，结合等温线毫无特征，拟合参数之间存在潜在相关性。此外，高c值的情况也存在问题：无法区分结合亲和力，只能估算结合常数的下限值。c值和ΔH值决定了结合等温线的几何特征。具体而言，结合等温线的整体偏转（y轴截距与高饱和状态下观察到的热量（即背景热或“稀释”热）之间的差值）与结合焓直接相关，等于c/(c+1)ΔH。摩尔比为1时，结合等温线的斜率与结合亲和力和结合焓直接相关，大致等于-0.25c 1/2 ΔH。如果c>1，结合等温线将出现拐点。

由于滴定曲率基于参数 c，给定结合亲和力，可以通过选择大分子浓度来调节该曲率。即使理想情况是 1 < c < 10000，但并非总是能够在此范围内进行，因为这可能意味着使用非常低的反应物浓度。如果实验体系表现出较高的亲和力（c > 10000）或非常低的亲和力（c < 1），则使用中等亲和力配体的置换滴定法有助于克服这一困难。

️实验步骤可设置如下：

• 通过将每个配体注入大分子进行两次滴定
• 通过将其中一种配体注入预先与第二种配体结合的大分子中进行第三次滴定（如果可能，第二种配体过量）
• 所有滴定，无论是二元滴定还是三元滴定，都可以用单结合位点模型进行分析

恒压下的结合热容量是结合焓的温度导数：既不独立也不竞争。图4展示了两个实验系统中的这一过程。

️图4.通过ITC评估异质相互作用。对于结合两种不同配体的大分子，可能存在三种情况：独立结合、协同结合和竞争性结合（最大负协同性）（左图）在没有配体2（实心方块）和有配体2（220 pM，空心方块）的情况下，用配体1（480 pM）对大分子（30 pM）进行滴定。使用具有配体1的单结合位点模型对两次滴定进行分析，可得出以下参数：K a 1 = 1.1-10 7 M -1，ΔH 1 = -5.2 kcal/mol，K a 12 = 3.1-10 1 M -1，ΔH 12 = -8.4 kcal/mol。使用配体 2 进行第三次滴定（未显示）可得出以下参数：K a 2 = 1.5-10 5 M -1，ΔH 2 = 3.1 kcal/mol。由于公式 15 不成立，配体 1 和配体 2 的结合并非独立发生。另一方面，假设配体 1 滴定过程中游离配体 2 的平均浓度为 205 pM，应用公式 16 可计算出配体 2 存在下配体 1 的结合参数值，K a 12 = 3.5-10 5 M -1和 ΔH 12 = -8.2 kcal/mol，这与直接测定的值非常接近（在实验误差范围内）（即公式 16 成立）。因此，可以得出结论，配体 1 和配体 2 存在竞争性结合（a ≈ 0，Ah ≈ 0）。 （右图）在不存在配体 2（实心方块）和存在配体 2（50 pM，空心方块）的情况下，用配体 1（260 pM）滴定大分子（21 pM）。使用配体 1 的单结合位点模型对两次滴定结果进行分析，得到以下参数：K a 1 = 9.2·10 5 M -1，ΔH 1 = 3.7 kcal/mol，K a 12 = 2.3·10 5 M -1，ΔH 12 = 5.3 kcal/mol。用配体 2 进行的第三次滴定（未显示）得到以下参数：K a ,2 = 2.7·10 5 M -1，ΔH 2 = -2.1 kcal/mol。由于公式 15 不成立，配体 1 和配体 2 的结合不是独立发生的。另一方面，假设配体 1 滴定过程中游离配体 2 的平均浓度为 40 µM，应用公式 16 可计算出配体 2 存在时配体 1 的结合参数值，K a ,12 = 7.8•10 4 M -1和 ΔH 12= 5.6 kcal/mol，与直接测定的结果（即不满足公式16）存在显著差异（在实验误差范围内）。因此，可以得出结论，配体1和配体2协同结合。由于配体2的存在导致配体1的结合亲和力降低，因此结合协同性为负。利用公式16可以估算协同性参数：α = 0.18，Δh = 1.6 kcal/mol（即，如果配体2与大分子结合，配体1的结合亲和力降低5倍，其结合焓增加1.6 kcal/mol）。

通过在相同的pH、温度、离子强度等条件下，并使用不同电离焓的缓冲液进行ITC实验，可以评估与配体结合偶联的质子交换过程，并估算与缓冲液无关的结合焓和净质子交换量。图5展示了该实验流程。

️图5.与配体结合偶联的质子交换构成了配体结合相互作用pH依赖性的分子基础。在相同条件下（25°C，pH 7，NaCl 150 mM），采用pKa相似但电离焓不同的缓冲液（PIPES 2.68 kcal/mol，MOPS 5.05 kcal/mol，咪唑 8.77 kcal/mol），对两种不同的配体（空心方块和实心方块）进行量热滴定。由于测得的焓明显依赖于缓冲液的电离焓，且斜率为负，因此可以得出结论：大分子-配体复合物的形成伴随净去质子化。两种配体的斜率相似，接近于1，因此，至少有一个质子从复合物中释放到本体溶液中。然而，两种配体的缓冲液非依赖性结合焓明显不同：9.3 kcal/mol 和 0.2 kcal/mol。在 pH 7 附近（至少 | ApH | < 2），根据公式 13，pH 的增加/减少将导致两种配体的结合亲和力增加/减少；具体而言，pH 值每变化 1 个单位，平衡结合常数将增加/减少约 10 倍。

图 6 显示了特定结合相互作用的热力学结合曲线的温度依赖性，假设结合热容量恒定。

️图 6.大分子-配体相互作用的热力学结合曲线的温度依赖性，其结合参数如下：K a = 10 6 M -1、AG = -8.2 kcal/mol、ΔH = -4 kcal/mol、-TAS = -4.2 kcal/mol 和 ACP = -0.3 kcal/mol。ΔH 的斜率等于 ACP，而 -TAS 的斜率等于 -(ACP+AS)；因为通常 ACP 比 AS 大得多（在实验温度范围内），焓和熵贡献的斜率非常相似，导致吉布斯结合能对温度不太敏感。因此，可以观察到平衡结合常数随温度的变化很小，再加上通常的实验不确定性，使得通过范特霍夫关系估算结合焓非常具有挑战性。根据范特霍夫关系，结合焓在温度 TH（本例中接近 12°C）时为零，该温度是平衡结合常数达到最大值的温度。熵贡献在温度 TS（本例中接近 39°C）时为零，该温度是吉布斯结合能达到最大值的温度。

️结论

ITC 是表征相互作用的强大工具，尤其适用于表征各种结合亲和力的生物分子相互作用。ITC 的不同领域和应用包括：

• 蛋白质调控和功能
• 蛋白质工程与功能重新设计
• 药理学/生物技术目标的表征
• 药物研发中的先导物选择
• 药物开发中的先导物优化
• 开发药物载体以增强治疗效果
• 临床前试验（例如血浆蛋白结合、通过不需要的靶点产生的潜在副作用）
• 开发和改进蛋白质相互作用计算模型的实验基准
• 制药、化妆品、食品、清洁和生物技术行业的蛋白质/生物制剂生产的质量控制。