异源体系进行植物激素转运蛋白功能研究

植物激素是调整植物体生长发育、形态建成与逆境响应等的重要信号分子，植物激素通常在植物的特定部位合成，并通过维管系统运输至其他组织和器官来发挥功能，同时一些植物激素 在细胞内合成后转运至邻近细胞。

近年来许多植物激素转运蛋白相继被发现和功能鉴定，然而，激素转运机制的复杂性使得在原生植物体系中进行研究面临挑战。异源体系在生物学研究中始终发挥着重要的作用，由于缺乏稳定遗传转化体系，生长周期长等因素，许多研究在原本物种内进行会出现困难。异源体系通过将目标基因导入非原生宿主，可实现在简化背景下研究特定蛋白的功能。

目前，许多体系被应用于异源研究植物激素转运蛋白的功能，最常见的如酵母、爪蟾卵母细胞。将转运蛋白基因转入爪蟾卵细胞或缺陷型酵母细胞中表达后, 通过气/液相色谱-质谱联用技术检测细胞内外激素含量，从而得到转运蛋白对底物的转运效果。

植物中转运蛋白家族成员功能重叠，基因敲除突变体常因代偿效应难以呈现显著表型，导致研究困难。

与爪蟾卵母细胞相似，在酵母中进行转运蛋白研究的传统方法是对缺乏转运体的突变酵母进行功能互补，利用气/液相色谱-质谱联用技术检测转运效果。

2024年发表在Plant Physiology上的研究论文️Abscisic acid root-to-shoot translocation by transporter AtABCG25 mediates stomatal movements in Arabidopsis，研究利用在酵母体系中异源表达AtABCG25，将酵母于2H6标记的ABA以及ABA-GE溶液中培养，通过 HPLC-MS/MS 定量检测外排液中ABA浓度，结果表明与空载相比，转化AtABCG25的酵母菌外排液中有更高含量的ABA及ABA-GE。由此，明确转运蛋白 AtABCG25 是 ABA 和 ABA-GE 的外排转运蛋白。

图 AtABCG25转运ABA和ABA-GE活性研究

但随着一种特殊的酵母双杂交体系得到开发，得以更高明的间接探究植物激素转运蛋白功能。

2012在 PNAS上发表了一篇题为“️Identification of an abscisic acid transporter by functional screening using the receptor complex as a sensor”的研究论文。该研究利用依赖ABA产生互作的ABA受体PYR/PYL/RCAR与PP2C 型蛋白磷酸酶构建了酵母双杂交系统，将PP2C 型蛋白磷酸酶与 GAL4 转录激活结构域（AD）连接，将 ABA受体与GAL4 DNA结合结构域连接，以HIS作为报告基因，同时共转拟南芥cDNA文库质粒。当拟南芥cDNA文库中存在ABA转运蛋白时，ABA被转运至酵母菌内，ABA依赖型互作发生，酵母菌在HIS缺陷型平板上生长。研究通过该体系得到了4个候选ABA转运蛋白（AIT）基因 At1g69850 （NRT1.2）、At1g27040、At3g25260 和 At3g25280。

图 部分NRT1/PTR 家族基因对 AD-ABI1 和 BD-PYR1 之间 ABA 依赖性相互作用的影响

随后研究还针对转化空载、AIT1、AIT3的酵母菌内ABA含量进行了测定，证实AIT1和AIT3可以介导ABA向酵母菌内转运。

图 不同浓度ABA处理条件下酵母菌内ABA含量测定

当然，利用酵母体系不仅可以研究介导激素摄入蛋白，也可以针对激素外排蛋白进行研究。

2024年，在Molecular Plant在发表的题为“️Endomembrane-biased dimerization of ABCG16 and ABCG25 transporters determines their substrate selectivity in ABA-regulated plant growth and stress responses”的研究论文，研究利用低浓度ABA促进，高浓度ABA抑制互作的两个蛋白PYR1/ABI1，构建酵母双杂交体系。

检测了高浓度ABA处理下，转化ABCG16基因的酵母菌相比于空载（M52）对照组生长更优，这个结果表明ABCG16可以通过ABA的外排，降低酵母菌内ABA浓度，从而减少高浓度ABA抑制互作导致的酵母菌生长抑制，因此ABCG16很可能作为介导ABA外排的蛋白发挥作用。

图 酵母双杂交系统验证ABCG16 介导的细胞 ABA 外排

利用爪蟾卵母细胞进行转运蛋白功能研究是通过将转运蛋白基因转入爪蟾卵细胞中表达后, 对胞内和胞外的植物激素分子进行示踪分析, 通过气/液相色谱-质谱联用技术检测转运蛋白对底物的转运效果。

2023年发表在Nature Plants上的研究论文️Cryo-EM structure and molecular mechanism of abscisic acid transporter ABCG25，研究利用非洲爪蟾卵母细胞验证转运蛋白AtABCG25的ABA转运功能，通过将GFP-AtABCG25 的互补RNA（cRNA）注射到爪蟾卵母细胞，将卵母细胞于含ABA的缓冲液共孵育，最终利用液相色谱-质谱检测卵母细胞中的ABA含量，结果表明，AtABCG25 的表达从卵母细胞中输出大量的 ABA。

图 AtABCG25 的ABA转运活性测定

今天我们介绍了异源体系在植物激素转运功能研究中的作用，其原理为在转运蛋白作用下植物激素从膜的一端转移至另一端，同时异源表达系统可以将的目的蛋白在异源体系中表达。使得研究人员通过分析膜两侧植物激素的浓度变化即可判断某个蛋白是否为植物激素的转运蛋白。该技术使得植物激素转运蛋白的研究研究背景得到了简化、实验周期得到了缩短。在此基础上，结合酵母双杂交筛选的原理，我们不光可以验证某个转运蛋白的功能还能筛选出潜在的转运蛋白，这一精巧的创意极大地扩宽了植物激素转运蛋白研究思路，希望这种创新的想法能够给大家带来一些帮助！