在浓香型白酒模拟发酵体系中接种酪丁酸梭菌与酿酒酵母以定向强化微生物协同作用提升关键风味代谢物
浓香型白酒（SFB）是中国的一种蒸馏酒，由不同谷物（主要是高粱）在泥坑中自发固态发酵生产而成，占中国白酒市场的70%以上。己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯及其相应脂肪酸之间的比例对白酒的香气特征极为重要。目前，传统酿造工艺中影响白酒品质的重要微生物与关键风味代谢产物形成的内在关系尚未理清，可能导致发酵粮食（FG）中己酸乙酯、丁酸乙酯等重要风味物质产生不稳定，从而降低白酒的品质。窖泥（PM）中的微生物在很大程度上决定了白酒的风味和质量，对脂肪酸和脂肪酸乙酯的生物合成有重要贡献。最近的研究表明，FG和PM微生物的协同作用推动了SFB典型风味的形成。
2024年6月15日，由北京工商大学Fanghang Qiu、Weiwei Lia为第一作者，在《Food Research International》（IF=7）上发表的题为“Targeted microbial collaboration to enhance key flavor metabolites by inoculating Clostridium tyrobutyricum and Saccharomyces cerevisiae in the strong-flavor Baijiu simulated fermentation system”的文章，研究通过设计有针对性的微生物协作模式对发酵过程进行生物强化是稳定白酒品质的有效方法。我们首次探索了酪酸梭菌DB041和酿酒酵母YS219共培养液体发酵条件下的新陈代谢，研究了接种两种功能微生物对固态模拟发酵SFB的理化因子、风味代谢产物和微生物群落的影响。这项研究有助于更好地利用特色微生物资源，研究它们在白酒发酵中的独特作用，并为优化不同批次白酒的稳定生产提供有价值的见解。
️一、确定协作菌株的最佳比例
通过纯培养与共培养代谢分析发现，一株高产丁酸并兼具己酸合成能力的菌株DB041。该菌能以葡萄糖和乙酸为底物合成丁酸和己酸。研究进一步采用产酯酵母YS219以1:2、1:1和2:1比例共培养，结果显示1:1比例发酵时葡萄糖消耗最快，丁酸和己酸产量达峰值。窖泥中的厌氧产酸菌是白酒发酵中短链脂肪酸合成的关键功能菌，而构建合成微生物群落能通过代谢互补提升有机酸产量，其效果优于纯培养体系。基于液态发酵优化的最佳菌种比例，后续将应用于固态模拟发酵体系以验证其风味增效作用。
图1.丁酸产量对产酸厌氧菌（aPAB）的筛选和鉴定。
图2.酪酸梭菌DB041和酿酒酵母YS219不同比例液体发酵的代谢特征。
️二、固态模拟发酵过程中FG的物理化学因素和酶指标
单独接种酿酒酵母对发酵体系的扰动有限，而双菌共接种显著提升了淀粉分解效率和还原糖利用率，同时水分含量增加24.2%，表明微生物代谢活性显著增强。关键酶活分析发现，C组发酵30天时糖化力、液化力）和酯化力均显著高于对照组（P < 0.05），其中酯化能力的提升尤为突出，这对浓香型白酒主体香气成分己酸乙酯的合成至关重要。值得注意的是，双菌协同作用还能适度降低发酵糟醅酸度，同时酸性蛋白酶活力在发酵末期达到56.56±2.681 μg/g·min，有利于蛋白质分解及风味前体物形成。研究表明，构建的酪丁酸梭菌与酿酒酵母协同发酵模式在原料利用、酸度调控和酯类合成方面具有显著优势，为浓香型白酒风味定向调控提供了新的微生物组合策略。
图3.不同组固体模拟发酵谷物的理化指标和酶学指标。
️三、对不同添加比例的FG风味代谢物进行分析
研究通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测了67种风味物质，系统探究了酪丁酸梭菌与酿酒酵母不同接种比例对白酒发酵风味代谢的影响。双菌协同发酵显著提升了酯类物质合成。多元统计分析显示不同接种组风味代谢物存在显著分离，其中VIP > 1且OAV > 1的丁酸丁酯、丁酸、己酸乙酯等被确定为关键差异风味物质。单独接种酪丁酸梭菌虽能显著提高丁酸和1-丁醇产量并合成特征性丁酸丁酯，但过量的丁酸类物质导致酸味突出、风味协调性下降。而C组通过酵母的乙醇供给与酸度调控作用，在提升中链脂肪酸酯含量的同时，将乙酸和乳酸分别控制在较低水平，形成更平衡的风味剖面。感官评价进一步证实，C组蒸馏酒样的水果香、花香和甜香显著优于对照组，且避免了A组明显的酸味缺陷。该研究揭示了酪丁酸梭菌与酿酒酵母1:1共接种可通过代谢互补实现原料高效转化与风味协同增效，为浓香型白酒风味精准调控提供了可靠的微生物组合方案。
图4.浓香型白酒固态发酵的风味代谢物汇总。（A）风味代谢物分类柱状图。（B）风味代谢物热图分析。（C）不同组的部分最小二乘判别分析（PLS-DA）。(D)不同组的层次聚类分析（HCA）。
图5.基于OPLS-DA模型的风味代谢物的得分图和预测变量重要性（VIP）值大于1的柱状图。
图6.不同组中主要风味代谢物及其前体的含量。
️四、发酵过程中FG微生物的多样性和组成
通过扩增子测序技术揭示了外源菌株接种对白酒发酵微生物群落的影响。α多样性分析显示真菌多样性始终低于细菌且随发酵进行呈下降趋势。PCoA分析证实不同接种比例显著改变了微生物群落结构。线性判别分析（LEfSe）发现，魏斯氏菌、片球菌和狭义梭菌12分别是A、B、C组的细菌生物标志物，而酿酒酵母（C组）和伊萨酵母（CK组）为真菌标志物。值得注意的是，C组中狭义梭菌12的相对丰度较A组提高56.1%，表明接种的酪丁酸梭菌能有效定植发酵体系，这与该菌利用乳酸/乙酸作为碳源的特性相关。研究同时发现，乳酸菌（如耐酸魏斯氏菌）在风味物质（如丁酸乙酯、己酸乙酯）合成中起重要作用，而实验室条件下酿酒酵母能快速成为优势菌群。这些微生物群落差异与前期研究的风味物质特征形成机制相互印证，为理解微生物-风味代谢关联提供了群落层面的理论依据。
图4.固态发酵中微生物群落结构分析（SFB）。
️五、微生物群落、物理化学因素与关键风味代谢物之间的关系
研究通过Mantel检验和共现网络分析揭示了外源菌株接种对白酒发酵体系中理化因子与微生物群落互作关系的影响，证实了高水分环境通过降低氧分压促进厌氧菌生长。共现网络分析显示，C组中乳酸菌（魏斯氏菌、乳酸杆菌等）与关键风味酯类（丁酸乙酯、己酸乙酯）存在显著正相关，且狭义梭菌12与酿酒酵母、毕赤酵母形成独特互利关系—酵母通过耗氧为梭菌创造厌氧环境，同时缓解葡萄糖对产酸菌的抑制，而毕赤酵母与酿酒酵母的协同作用可增强有机酸胁迫下的微生物活力。
图5.通过Mantel检验和共现分析，微生物群落、物理化学因素与风味代谢物之间的相关性。
️总结
本研究发现，接种酪丁酸梭菌与酿酒酵母是提高关键风味代谢物的一种潜在方法。通过设计有针对性的微生物合作模式，对发酵过程进行生物强化，促进了丁酸乙酯和己酸乙酯的生产。微生物分析表明，己酸乙酯和丁酸乙酯与以乳酸菌为主的相互作用群显著相关，而乳酸菌相互作用群是由功能性酪丁酸梭菌与酿酒酵母驱动的。这项研究有助于更好地了解SFB发酵过程中生物扰动对微生物协作的影响。然而，功能微生物的协同效应与风味代谢物的产生机制之间的关系还有待进一步研究。
