以精子抗原肽为抗原的抗精子抗体ELISA检测方法的建立

摘要：目的 建立组合多个精子抗原肽为抗原的检测抗精子抗体的酶联免疫吸附测定 (ELISA) 法。方法 用PS3全自动多肽合成仪合成4个特异精子肽, 并经反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 纯化和质谱鉴定。用ELISA检测4个合成肽的抗原性, 基于对这些合成肽抗原活性的评价, 将4个精子抗原肽混合后 (组合肽) 作为抗精子抗体 (AsAb) 检测用抗原。结果 合成了实验所需要的抗原性肽段, RP-HPLC结果显示纯度达95%以上。以组合肽为抗原建立的检测AsAb的间接ELISA方法, 与商品化试剂盒相比符合率为95.6%。结论 固相多肽合成技术可用于合成高纯度的精子抗原肽, 以组合的精子抗原肽作为包被抗原建立的ELISA方法可提高AsAb检测的灵敏度。

️关键词： 固相多肽合成 精子抗原肽 抗精子抗体 酶联免疫吸附试验

世界卫生组织的研究资料表明, 不孕不育症发生率平均约占已婚夫妇的20%, 其中免疫性因素占10%～20%。而在免疫性不育中, 最常见的是抗精子抗体 (AsAb) 所导致的生殖障碍, 9%～36%的不孕症夫妇存在AsAb [1] 。因此, 在诊断免疫性不孕时检测AsAb具有重要意义。目前, 血清中AsAb阳性已被列为人类免疫性不孕的确定指标之一。我们曾合成了人精子蛋白17 (SP17) 的一个免疫优势的线性B细胞表位 (118～127aa) , 序列为AVKIQAAFRG, 并将它称为AG10, 用以建立AsAb的酶联免疫吸附测定 (ELISA) 检测方法。在此基础上, 我们选择另外3个精子抗原的线性B细胞表位进行研究。P10G 序列 (PGGGTLPPSG) 来自一个相对分子质量 (M r) 为14 000的兔精子自身抗原, O′Rand等 [2] 研究表明来自输精管手术的男人和不孕妇女的血清与合成肽P10G发生免疫反应。YLP12序列 (YLPVGGLRRIGG) 是一段位于人类精子细胞顶体区域的肽序列, 具有睾丸特异性, 与人类精子和透明带的识别和结合有关 [3] 。IR9序列 (IQTLGITPR) 来自一新的特异性人精子蛋白 (FJ32704) [4] 。经实验证实, 4个肽段均具有较高的抗原活性, 在ELISA中用4个肽段混合包被固相载体效果更佳。本文报道4个肽段的合成方法和在检测抗精子抗体ELISA方法中的应用。

️1.1 精子抗原肽的固相合成、纯化及鉴定

采用固相多肽合成技术, 在PS3全自动固相多肽合成仪上, 以N-α-Fmoc保护的氨基酸为原料, Rink氨基树脂为载体, 20%哌啶DMF溶液为脱保护剂, HBTU为肽键缩合剂, 按己知序列从C端到N端的顺序依次偶联合成。合成结束, 用裂解液, 即TFA-苯甲硫醚-苯甲醚-二巯基乙烷 (90∶5∶2∶3) 将合成多肽从树脂上裂解下来, 同时脱去所有保护基团。用-20 ℃无水乙醚使抗原肽沉淀, 离心收集沉淀, 用氮气吹去乙醚, 即得合成肽的粗品。合成肽粗品经反相高效液相色谱 (RP-HPLC) (C18色谱柱) 分离纯化, 收集主峰, 冷冻干燥后得到较纯的合成肽。纯化后的肽进行质谱 (吉尔生化上海有限公司) 鉴定, 将质谱分析的荷质比与预测的理论M r进行比较。纯化后的抗原肽用RP-HPLC分析其纯度, 色谱条件:色谱柱Jupiter Proteo (250 mm×4.6 mm, 4 μm) ;柱温:35 ℃;流动相A:0.1%TFA溶液;流动相B:0.1%TFA乙腈溶液;线性梯度洗脱:15%B→40%B, 25 min;流速:1.0 mL/min;检测波长:220 nm。

️1.2 ELISA试验

️1.2.1 PLL预包被的间接ELISA方法

将PLL (M r为30 000～70 000) 溶解在PBS中, 终浓度为40 μg/mL, 酶标板每孔加入100 μL, 置4 ℃, 24 h后, PBS洗涤1次, 加入1%戊二醛PBS 100 μL, 室温下孵育15 min, PBS洗涤3次。用PBS稀释待反应的肽段, 在PLL预处理的板条孔中, 每孔加入100 μL, 室温过夜, PBS洗涤3次。剩余的活化醛基用1 mol/L甘氨酸溶液封闭, 室温过夜, PBS洗涤1次。拍干后每孔加封闭液350 μL, 置4 ℃, 24 h, PBS洗涤3次, 室温干燥后封袋, 4 ℃保存。每孔加入预先用样品稀释液稀释100倍的血清标本100 μL, 置37 ℃水浴保温1 h。洗涤5次后甩干, 每孔加入工作浓度的酶标抗体 (羊抗人IgG-HRP) 100 μL, 置37 ℃水浴保温1 h。洗涤5次后甩干, 每孔加入TMB底物溶液100 μL, 置37 ℃水浴保温15 min。每孔加入1 mol/L H2SO4溶液 50 μL终止反应, 在450 nm波长处测定吸光度值。临界值为阴性对照平均值的2.1倍。

️1.2.2 各精子抗原肽的抗体反应性测定

利用棋盘方阵滴定方法确定了精子抗原肽最佳包被浓度为5 μg/mL。将4个精子抗原肽P10G、YLP12、AG10和IR9用PBS稀释至终浓度为5 μg/mL, 以每孔100 μL进行包被。然后按2.2.1项下方法进行测定。共测定AsAb阳性血清40例。

️1.2.3 AsAb (IgG) 的测定

根据对以上4个精子抗原肽抗体反应性的测定结果, 4个精子抗原肽均有较强的抗原活性, 所以将4个精子抗原肽混合后 (组合肽) 进行联合包被, 使各肽终浓度为5 μg/mL。其它步骤按2.2.1项下方法进行。对AsAb阳性血清40例, 阴性血清50例进行测定。

️1.3 统计学方法

使用统计软件SPSS115进行统计分析, 采用Kappa系数作为两种检验方法一致性的检验指标。

️2.1 精子抗原肽的纯度分析及质谱鉴定

纯化后的4个精子抗原肽经电喷雾质谱 (ESI-MS) 分析结果显示, 合成肽P10G、YLP12、AG10和IR9的荷质比分别为837.8, 1 257.0, 1 060.6和998.2, 均与该肽的理论M r相吻合, 证明纯化所得的物质为目的抗原肽。RP-HPLC分析, 按面积归一法计算, 纯化后的P10G、YLP12、AG10和IR9抗原肽纯度分别为97.5%, 97.8%, 95.5%和97.7%, 满足ELISA实验作为测定用抗原的需要。

️2.2 精子抗原肽抗体反应性的测定

将各精子抗原肽 (P10G, YLP12, AG10, IR9) 分别以5 μg/mL浓度包板, 测定40份阳性血清, 阳性率分别为77.6%, 75%, 85%, 82.5%。可见各精子抗原肽均具有较高的抗原活性且存在一定的互补。

️2.3 AsAb (IgG) 测定结果

在40份阳性血清标本中, 组合肽包被酶标板检测出36份为阳性, 4份为阴性;在50份阴性血清标本中, 组合肽包被酶标板检测结果均为阴性。组合肽包被检测灵敏度为90%, 特异性为100%。两种检验方法符合率为95.6%, Kappa值为0.91>0.75, 表明这两种方法的检验结果具有极好的一致性。测定结果显示, 组合肽包被要优于单一肽包被。

检测AsAb的方法很多, 应用最广的方法是ELISA法。但传统ELISA法是应用整精子或直接从精子上提取的可溶性抗原作为包被抗原 [5] , 由于精子来源有限, 且整精子或直接提取的可溶性抗原中含有许多非特异性抗原, 会导致AsAb检测结果出现假阳性。近年来, 人工合成肽作为ELISA试剂盒的包被抗原, 因其M r小, 结构简单, 无其它蛋白成分, 明显提高检出的特异性和敏感性而受到青睐。随着多肽合成技术及纯化方法的不断改进, 使人们可大量制备各种高纯度的抗原肽以解决抗原的来源问题, 且合成的抗原肽成分明确, 易于控制, 对AsAb检测试剂的标准化有着重要意义。

曾有用合成精子抗原肽检测AsAb的报道 [6-7] , 但建立的ELISA方法均是用合成精子抗原肽单个包被, 由于抗原表位的单一化可能使检测阳性率降低。因此, 设计基于多种表达抗原或合成肽联合包被ELISA试剂盒无疑会降低漏检率, 可较完善地检测血清中AsAb, 为临床诊断免疫性不育症提供更为可靠的依据。本研究应用Fmoc固相多肽合成法在PS3全自动固相多肽合成仪上合成了4个精子抗原肽P10G、YLP12、 AG10和IR9, 并经HPLC纯化、质谱鉴定证实其纯度达95%以上。通过免疫学测定, 证实4个肽均为高抗原活性的肽段, AsAb阳性检出率均达到或大于75%, 且4个抗原肽具有相似而互补性。以组合精子抗原肽包被的酶标板测定AsAb (IgG) 与商品试剂盒相比, 灵敏度为90%, 特异性为100%, 其灵敏度高于单个抗原肽的测定结果。

为了克服抗原肽M r小, 采用常规包被方法包被效率较低, 且优势抗原表位有限所以灵敏度较蛋白低的不足, 我们通过选择多个抗原性强的线性表位和采用PLL预包被的方法提高包被效率来提高检测的灵敏度, 取得了较理想的结果。但影响检测效果的不仅涉及精子抗原肽的选择与组合, 也涉及诸如精子抗原肽表位的立体构象与抗体结合的关系及抗原包被条件等其它因素。本研究结果表明用固相多肽合成技术合成的高纯度精子抗原肽组合作为包被抗原建立的ELISA方法可提高AsAb检测的灵敏度, 为进一步完善AsAb检测ELISA方法不仅在技术上而且在思路上提供了依据。

免责声明：本文为行业交流学习，版权归 原作者所有，如有侵权，可联系删除。