揭示酱香白酒发酵过程中产生高级醇的关键微生物及其组装过程
白酒品质受微生物群落及其代谢活动调控。酱香型白酒多轮发酵工艺易导致酒质不稳定，首轮基酒高级醇含量偏高，但相关微生物代谢机制尚不明确。因此，揭示高级醇合成的关键微生物及调控因素至关重要。
2024年6月12日，由贵州大学Junlin Wei为第一作者，在《Food Bioscience》（IF=4.8）上发表的题为“Revealing the key microorganisms producing higher alcohols and their assembly processes during Jiang-flavor Baijiu fermentation”的文章，通过气相色谱-质谱联用、高通量扩增子测序、宏转录组分析和培养依赖分析等技术，研究了酱香型白酒四个发酵周期中挥发性化合物和微生物群落的变化，确定了产生高级醇的关键微生物及其组装过程，为控制白酒发酵中高级醇的产生提供了依据。
️一、四个发酵周期中挥发性化合物的变化
主成分分析显示，不同发酵周期的挥发性化合物显著分离（P<0.01）。乙醇是影响白酒发酵性能的最重要指标，随着发酵周期的增加呈上升趋势，总酯、总酸和高级醇含量含量逐渐降低。其他芳烃化合物（如2-正丁基呋喃）的含量呈增加趋势，在第二、第三和第四次循环中，它们显著高于第一次循环（P<0.05）。
图1.发酵结束时发酵谷物中的挥发性化合物（n=12）。
图1.发酵结束时发酵谷物中的挥发性化合物（n=12）。（A）基于挥发性化合物的Bray-Curtis不相似性的主坐标分析（PCoA）。乙醇（B）、总酯（C）、总醇（D）、总酸（E）和总芳烃（F）在4次循环中的变化。每个值代表平均值，误差线代表标准差。*，P<0.05;**，P<0.01（Tukey检验）。
️二、四个发酵周期中微生物群落的变化
通过排列多变量方差分析（图2B和D），四个发酵周期在属分类水平上显著代表（P=0.001）不同的细菌和真菌组成。细菌方面：乳酸菌（Lactobacillus）在四个周期中丰度最高，随着发酵周期的增加其相对丰度逐渐下降;而克氏杆菌（Kroppenstedtia）、慢杆菌（Lentibacillus）、大洋芽胞杆菌（Oceanobacillus）、芽孢杆菌（Bacillus）和热放线菌（Thermoactinomyces）随着发酵周期的增加而增加。真菌方面：毕赤酵母属（Pichia pastoris）和酵母菌属（Saccharomyces）在第一发酵周期中占主导地位，但随着发酵周期的增加，其丰度降低，而接合酵母菌（Zygosaccharomyces）表现出最大的增加。但总体而言，随着发酵周期的增加，细菌和真菌的多样性均呈先增加后减少的趋势，其多样性在第2个周期达到最大值。
图2.四个周期中的微生物群落结构。属水平细菌群落（A）和真菌群落（C）的丰度和演替。
图2.四个周期中的微生物群落结构。属水平细菌群落（A）和真菌群落（C）的丰度和演替。仅标明平均丰度为>0.1%的属。每个属的相对丰度代表每个周期的平均值。基于细菌群落（B）和真菌群落（D）的Bray-Curtis差异的主坐标分析（PCoA）。*，P<0.05;，P<0.001（Tukey检验）。
️三、不同的挥发性化合物和微生物及其关系
确定了与挥发性化合物相关的关键微生物属，其中真菌属对微生物群落变化影响更大。通过Spearman相关性分析确定差异微生物与化合物之间的关系。结果表明，10个真菌属和9个细菌属具有显著关系（|ρ|>0.60和P<0.05）。其中异丁醇、异戊醇和1-丙醇是4个循环之间高级醇的主要指标。
图3.通过随机森林分析在四个循环中差异挥发性化合物（A）和微生物（B）。
图3.通过随机森林分析在四个循环中差异挥发性化合物（A）和微生物（B）。OOB（outofthebag）是错误率的估计值。准确率降低的平均值表示随机森林预测准确率的降低程度。（C）四个循环中差异挥发性化合物的热图。色标表示每种化合物的标度丰度，以Z分数表示，红色和蓝色分别表示高丰度和低丰度。（D）差异化合物与微生物之间的关系。
️四、与高级醇形成相关的活性功能微生物和代谢途径
酿酒酵母和4种非酿酒酵母是高级醇的主要产生菌。相关代谢途径涉及碳代谢、氨基酸代谢等，与高级醇形成相关的关键基因在第一周期的表达水平高于第四周期。在第一个周期中，S.cerevisiae显示关键基因的表达水平最高。而Z.bailii在第4个周期中表现出这些基因的表达水平最高。5种酵母菌株（S. cerevisiae, P. kudriavzevii, Z. bailii, S. pombe, and T. delbrueckii）是酱香白酒发酵过程中高级醇的主要生产者。
图4.发酵72小时（n=3）后，五种酵母菌株在高粱培养基中产生异戊醇（A）和异丁醇（B）。
图4.发酵72小时（n=3）后，五种酵母菌株在高粱培养基中产生异戊醇（A）和异丁醇（B）。*，P<0.05;**，P<0.01;，P<0.001（Tukey检验）。
️五、塑造产生高级醇类的微生物的生态过程和驱动因素
细菌群落组装主要受随机过程影响，真菌群落组装从随机向确定性过程转变，乳酸是驱动真菌群落组装的关键因素。细菌在所有发酵周期中，β最近分类指数值值都在-2和2之间，这表明细菌群落主要由随机过程构建（图6A）。其中，扩散限制和非主导过程在细菌群落的组装中尤其占主导地位（图6B）。真菌群落组装随着发酵周期的增加，从随机（|βNTI|<2）设置为确定性进程（|βNTI|>2）（图6C）。在第一和第二周期中，真菌群落主要由随机过程构建，其中扩散限制和非主导过程尤为重要。随着发酵周期的增加，确定性过程在第三和第四周期中主导了真菌群落组装，其主要是通过同质选择（图6D）。在第二个周期中，同质选择占真菌组装过程的26.67%，表明真菌组装转向同质选择。其中乳酸是多循环酱味白酒发酵过程中微生物向产生高级醇类的确定性过程组装的主要驱动力。
图5.微生物群落组装的生态过程和驱动力分析。（
图5.微生物群落组装的生态过程和驱动力分析。（A）细菌群落和（C）真菌群落的β最近分类指数值的分布。每个值是每个周期内每个发酵时间内成对社区比较的平均值。基于βNTI和RCbray值的不同生态过程在控制（B）细菌群落和（D）真菌群落中的相对贡献。（E）四个周期中发酵参数和差异真菌属的冗余分析（RDA）。置换多变量方差分析表明发酵参数对真菌属的意义。R2表示差异量。，P<0.001。
️总结：
高级醇在决定白酒的品质方面起着至关重要的作用。然而，过量的高级醇会导致苦涩的味道。在本研究中，异丁醇、1-丙醇和异戊醇是主要的高级醇，在四种循环间差异显著，其中第一循环高级醇含量最高，这主要是因为在第1周期酿酒酵母丰度较高。酵母群落是高级醇的主要产生者，微生物群落组成差异是挥发性化合物变化的主要原因，调节酿酒酵母和毕赤酵母的比例可能控制高级醇的产生。在酱味白酒发酵过程中，细菌主要由大曲为发酵谷物提供；真菌尤其是酵母菌，主要来源于发酵环境（室内地面和工具），其中指向确定性过程的真菌组装表明真菌有很强的环境选择。基于生态位的选择在调节微生物群落组成和风味代谢物方面起着至关重要的作用，而乳酸在真菌群落组装中起重要作用，随着发酵周期的增加、乳酸水平的逐渐增加，接合酵母成为优势酵母，这项发现为酱香白酒发酵中控制高级醇的产生提供了方向。
