光学前沿 | 可编程孔径光场显微镜

光学显微镜为观察生物样本在细胞和亚细胞尺度上的精细结构和动态行为提供了一种强大的方法。通常，需要获取三维(3D)显微结构和功能，可以通过基于光-物质相互作用（如吸收、折射、散射和荧光辐射）的光场来表征和获取与样本相关的光场来恢复。其中，荧光蛋白或染料作为探针，利用不同的成像模式标记样本的分子结构，在生物医学研究中最近已被广泛使用。荧光分子的激发辐射的特异性和灵敏度使得具有3D成像和超分辨率成像功能的成像模式成为可能。常见技术，如结构照明显微镜、激发辐射耗竭显微镜、光激活定位显微镜和随机光学重建显微镜，可以通过操纵激发光实现点扩散函数调制或单分子定位，同时突破衍射极限的分辨率。

与传统的宽场荧光显微镜相比，由于观察到的样品较厚时检测信号包括聚焦和非聚焦荧光信号，因此不能直接用于光学切片。物理或生化门控技术试图获得局部目标信号，然后进行全局扫描，尽可能消除失焦杂散光的干扰。典型的成像模式包括共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜、双/多光子显微镜、光片显微镜和结构照明显微镜。相比之下，轴向扫描和聚焦扫描技术首先无差别地收集3D物体信息，然后通过去卷积算法抑制不希望的失焦信号。然而，在机械运动或介质变形下的扫描过程不可避免地伴随着运动惯性，这需要一些延迟时间进行稳定，从而限制了成像速度。或者，通过多焦点成像和光场成像可以获得包含多焦点或空间角信息的合成信号，以解耦重建。这些空间复用技术可以实现单次体积成像，但通常是以降低空间分辨率为代价。

Cai等人提出了一种称为可编程孔径光场显微镜(programmable aperture light-field microscopy, PALFM)的计算3D显微镜技术，用于无运动、高分辨率体积成像。作者证明，使用环形孔径可以灵活地操控无衍射贝塞尔光束来调制入射光场。该工作在期刊Laser & Photonics Reviews上以“Programmable Aperture Light‐Field Microscopy”为题发表。

荧光体积成像面临的主要问题是低至高维反向投影的不确定性。为了解决这个问题，作者提出了PALFM成像模式。图1(a)展示了PALFM系统的示意图，该系统基于现成的倒置荧光显微镜，并附加了一个可编程孔径模块，连接到显微镜的相机端口。一个SLM放置在额外的4f中继系统的傅里叶平面，以与物镜的瞳孔平面共轭。当物镜的焦平面保持不变时，可以通过在SLM上加载不同的编码图案来改变等效瞳孔，从而调制入射光场的角分量或空间频率。在这种计算光场成像模式中，3D-OTF可以方便地用于PALFM体成像。

提出的非相干傅里叶切片定理与之前为数字频域重聚焦提出的傅里叶切片摄影具有不同的含义，尽管它们具有相似的形式，即图像频谱等同于高维频谱空间中的一个切片。从数学上讲，前者关注3D物体频谱，而后者与4D光场频谱相关。从物理上讲，前者本质上源于波动光学模型，而物体频谱切片对应于通过孔径调制的贝塞尔型光束传播，而后者基于几何光学，光场切片与光传播的强度传输特性相关。作者采用非相干傅里叶切片定理作为开发PALFM断层成像的基础。PALFM可以在全传感器分辨率下对入射光场进行时间调制，克服了传统基于微透镜阵列的光场成像中通常不可避免的时空分辨率权衡。最近，提出了各种提高空间分辨率的技巧，例如傅里叶光场显微镜和扫描光场显微镜。相比之下，PALFM采用孔径调制来操控物镜光束，实现无运动、高分辨率的三维成像，无需机械装置进行样品旋转或光束扫描。

根据导出的非相干傅里叶切片定理，通过调制环形孔径可以获得具有不同法线方向的对象光谱切片。具体来说，环状孔径可以围绕光轴从不同角度旋转，以便反向投影的光谱切片逐渐填充对象光谱，如图1(b)右侧所示。在此，考虑了影响环状孔径调制与PALFM成像性能内在相关性的两个因素，为PALFM体成像设计了一种可选的孔径调制方案。

第一个是频率扩展。检测信号本质上决定了恢复对象频谱的截止频率。图1(b)显示了与全孔径相比，半截止频率旋转环形孔的示例。使用这些孔进行成像将丢失截止频率以上的高频对象信息，导致低分辨率体积成像。因此，应使用较大直径的环形孔来扩展频率范围，如图1(c)中相应的3D-OTF分布所示。设计具有不同直径和均匀围绕光轴旋转角度的环形孔。最终的3D-OTF分布及其沿每个轴的频谱截面在图1(d)中显示，其中不同的渲染颜色与不同的直径相关。随着直径逐渐增大，填充相应3D光谱空间所需的孔径数量逐渐减少，直到包含最大直径的环状孔径。此时，最终填充光谱的截止频率等于全孔径的截止频率，如图1(d)中的白色虚线所示，从而实现PALFM体成像的衍射极限分辨率。

第二个是频率覆盖。由环形孔径调制的平面形3D-OTFs的频率覆盖率相对较低。这意味着需要更多的环形孔径来填充整个3D频谱空间。为了提高成像效率，选择圆形孔径作为另一个基本元素进行孔径调制。作为比较，图1(e)显示了与图1(c)中环形孔径相同直径和旋转角度的圆形孔径的3D-OTF分布。显然，圆形孔径的甜甜圈形3D-OTFs的频率覆盖率高于环形孔径。然而，高覆盖率可能会在体素重建过程中伴随模糊的深度识别。为了避免模糊，应使用非中心对称的圆形孔径。图1(e)显示了与图1(d)中环形孔径相同直径和旋转角度的圆形孔径的3D-OTF分布及其沿每个轴的频谱截面。

通过全面考虑上述因素，作者设计了一种由非中心对称的环形和圆形孔径（直径和旋转角度不同）组成的混合孔径调制方案。因此，作者提出了一种适用于混合孔径调制方案的迭代重建算法。虽然环形孔径获得了优异的深度分辨力和较大的景深，但圆形孔径带来了高频覆盖率，实现了高质量的PALFM体成像。

作者通过采用混合孔径调制方案，在多种样品上实验证明了PALFM体成像。

PALFM的成像性能通过测量分辨率靶标进行测试。使用了20×、0.45 NA的物镜进行成像。根据瑞利准则，全孔径的理论横向和轴向分辨率极限分别为724 nm和5.27 µm。首先将分辨率靶标水平放置在焦平面上，环形和圆形孔径可能获得可比结果。因此，分别使用与图1(d、f)中的3D-OTF分布相关的环形和圆形孔径序列来执行PALFM断层重建。体积渲染结果如图2(a、b)所示，以及两个代表性轴向位置和y轴向投影的x-y切片。图2(c)绘制了图2(a、b)中由蓝色和红色线标记的轮廓。在焦平面上，使用圆形孔径的重建结果可以区分分辨率靶标的第10组、第4元素，大约相当于690 nm的横向分辨率。与环形孔径相比，横向分辨率提高至615 nm（第10组，第5元素），而当焦距离为1.4 µm时，物体信息几乎无法区分。图2(d)绘制了相关数据以及重建体积在z轴上的最大强度投影（MIP）的高斯拟合曲线。通过测量半最大值全宽，与环形和圆形孔径序列相关的轴向分辨率分别被证实为≈5 µm和≈1.3 µm。

接下来，通过显微镜的位移平台将分辨率目标转换为不同的轴向位置。在每个位置，使用由非中心对称的环形和圆形孔径组成的混合孔径调制方案进行体积重建，同时将圆形孔径的结果用作参考。图2(e)分别显示了在10、50和70 µm轴向位置重建结果的放大局部视图。此外，图2(f)绘制了在80 µm深度范围内轴向位置变化时横向和轴向分辨率的直方图。可以看出，混合孔径调制方案在整个40 µm深度范围内实现了近衍射极限的成像性能，横向分辨率为870 nm（组10，元素2），轴向分辨率为≈6 µm。相比之下，当轴向位置超过10 µm时，使用圆形孔径的空间分辨率迅速下降。

作者进一步通过实验展示了使用混合孔径调制方案进行的高分辨率、多色、无运动PALFM体积成像在生物样本中的应用。使用40×、0.95 NA物镜对小鼠肾脏切片进行连续激发三种不同波长的光束，并进行成像。图3(a)综合展示了沿z轴和x-z、y-z两个垂直平面（由虚线白线标记）的MIP及切片的肾小球部分的多色重建结果。具体来说，图3(b)中从左到右不同颜色的3D渲染视图显示了肾小球的基本形状、颗粒状核和肾小球中的丝状肌动蛋白，分别对应不同的荧光染料和激发光束。这些结果直观地展示了肾小球的内部结构和形态。例如，细小核被丝状肌动蛋白紧密覆盖，如图3(a)中的白箭头所示。与图3(b)中第一个3D渲染视图相关的详细深度横截面显示在图3(c)中，展示了肾小球结构的骨架。为了验证PALFM断层扫描重建的准确性，使用激光扫描共聚焦显微镜对样品的同一区域进行成像作为参考。图3(d)显示了不同轴向位置上颗粒核的两个横截面的比较结果。四个感兴趣区域的放大图以及用绿色和橙色线标记的绘图轮廓清楚地显示了两种成像方式获得的形态分布和结构特征的一致性。共聚焦显微镜通常需要一个机械装置来驱动聚焦光束以全局扫描样品，从而可以获得更深的体素信息。PALFM可以通过灵活的孔径调制获得与共聚焦显微镜相当的结果，而不需要机械位移，单通道成像时间约为1秒。然而，共聚焦显微镜的单通道扫描时间约为5分钟，比PALFM小两个数量级。

PALFM也适用于通过可编程孔径的灵活调制进行长期时间间隔3D观察活细胞。在本实验中，体外培养的HeLa活细胞被制备为观察样本。相机的采集速率可达数百帧；然而，PALFM体视成像(≈1 Hz)的速度主要受SLF刷新率(60 Hz)的限制。这种成像速度足以观察HeLa细胞的时空形态变化。HeLa细胞通过PALFM进行了超过3小时的成像。图4(a)显示了观察期间四个代表性时刻重建体积的3D渲染视图，清楚地可视化动态亚细胞过程。在此，分析图4(a)中标记为Cell A和Cell B的两个细胞的动态过程。在不同时刻选择的两细胞的三个深度横截面被放大，以展示亚细胞特征和细节，如图4(b,c)所示。在早期阶段（见图4b），细胞A的细胞质囊泡（用白箭头指示）在不同轴向位置随时间主动改变其大小和方向。在最后阶段（见图4c），大部分囊泡消失，整个细胞上浮并分解成碎片。相比之下，细胞B的伪足从开始就逐渐收缩，细胞收缩并变圆。特别是在图4(a)中第二个3D渲染视图对应的具体时刻，一个凋亡体（用白箭头指示）从细胞表面脱落并开始随液体漂浮。此外，细胞B在最后阶段伴随着泡状结构的形成，如图4(c)中的白箭头所示。这些现象揭示了细胞凋亡过程，并表明PALFM是一种有潜力的断层扫描成像模式，适用于高速、长期的时间间隔观察和研究动态亚细胞过程和事件。

在启用光场调制和断层扫描成像功能的同时，可编程孔径模块仍面临一些问题。一方面，如图所示，在活细胞成像实验中，PALFM体成像的速度受图案刷新和图像获取速率的限制。使用更高刷新率的SLM将使PALFM具有更高的时间分辨率。另一方面，编码孔径的形状、大小和数量仍不理想。孔径调制与成像性能之间的内在相关性需要进一步研究、量化并建模，以从相应构建的能量方程中探索最佳孔径调制方案。例如，使用复合编码可以提高高速 PALFM 体成像的编码效率。此外，在实验中仅使用可编程孔径的幅度进行孔径调制，这可能会伴随低光子效率的问题。孔径调制的维度可以扩展到其他光学参数，如相位和偏振。如果调制维度和编码策略在孔径调制中进一步结合，具有高时空分辨率的PALFM可能扩展其潜在应用，例如观察亚细胞生命-物质相互作用。然而，由于是多帧调制模式，且在可编程孔径模块中使用SLM仍因偏振而在一定程度上牺牲了光子效率，因此PALFM可能不适用于具有高动态和低光效的样本，如瞬态神经活动。

PALFM专注于荧光或自发光显微镜成像，其中通常使用荧光探针进行外源性标记，以高对比度观察细胞和亚细胞结构。然而，对于这种标记成像模式，对生物体与其周围环境的整体观察是困难的。相比之下，无标记显微镜成像，如傅里叶频谱显微镜和光学衍射断层扫描，利用光-物质相互作用的固有特性，以避免光毒性和对生物细胞和组织活性的光漂白效应。然而，在透明或半透明样品中缺乏特异性和灵敏度可能导致成像对比度低。最近，研究了将荧光显微镜成像与光学衍射断层扫描或相位成像相结合的多模态成像，以获得互补性能。PALFM可以与其他成像模式结合，以同时操纵照明和检测光束进行多模态成像，进一步扩大下一代计算光学显微镜的开发空间和应用范围。值得注意的是，多模态成像并非不同成像模态获得的成像性能的简单叠加。观察样本的特征和重建算法也可能影响成像性能。例如，当样本复杂折射率引起的干扰足够大，足以在环状孔径调制下对贝塞尔光束产生不可忽略的畸变时，衍射效应可能会使非相干傅里叶切片定理在一定程度上失效。不同成像模态之间的内在相关性将成为未来一个值得深入研究的主题。

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