行为学实验 | 未知为何让人更焦虑：不可预测应激诱导焦虑的环路机制
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恐惧和焦虑是不同的适应性反应，对生存至关重要。恐惧是由离散且确定的威胁刺激引发的，而焦虑则源于对潜在威胁的预期。杏仁核中央核（CeA）对于离散条件化恐惧反应的获得和表达至关重要，其在僵硬行为中的特定神经元亚群的作用也已得到充分证实。以往的研究强调了终纹床核（BNST）在应对不可预测或持续时间较长的威胁时的防御反应中的作用。然而，与不可预测威胁处理和病理性焦虑相关的神经环路仍然知之甚少。
在此，作者通过使用改良的可预测CS（CS⁺）或不可预测CS（CS⁻）动物模型，发现岛叶皮层对vBNST的兴奋性输入和杏仁核侧核（CeL）对vBNST的抑制性输入协同作用，触发vBNST中GABA能神经元对不可预测而非可预测威胁信号的选择性激活。作者进一步发现，vBNST中的GABA能神经元通过投射到杏仁核中央核（CeM）和腹侧导水管周围灰质（vlPAG）分别调节焦虑样行为和僵硬行为。
️1.vBNST中特定的GABA能神经元群体调节对不可预测威胁的反应
为了确定vBNST在应对不可预测威胁时的神经元动态，小鼠接受了改良的恐惧条件反射（FC）任务训练。CS+和CS-信号均能引发小鼠的冻结行为（图1A和1B）。晚期FC试验中对CS-的神经反应显著强于适应期和早期FC试验（图1B-1E）。在CS测试实验中，vBNST神经元的Ca2+信号在CS-测试期间选择性增加，而在CS+测试期间没有变化（图1F和1G）。vBNST中Vgat神经元的Ca2+信号在CS-测试期间显著升高（图1H-1L）。作者的结果表明vBNST中的GABA能神经元在应对不可预测威胁信号时被选择性激活。并且研究了vBNST GABA能神经元在应对不可预测威胁时的防御行为中的作用。在CS测试期间人工抑制vBNST中的GABA能神经元，对CS-的冻结行为减少，而对CS+的冻结行为正常（图2D和2E）。在没有CS回忆的新环境中人工激活了vBNST中的CS-反应性神经元群体，发现ChR2-mCherry组的冻结行为增加（图2M）。这些发现表明vBNST中不同的GABA能神经元分别调控冻结和摄食行为。
图1. 皮层-脑干缓慢呼吸环路的鉴别
图2. vBNST中的GABA能神经元调节对不可预测威胁的反应
️2. 激活IC-vBNST回路对应对不可预测威胁至关重要
IC（岛叶皮层）、CeL（中央杏仁核外侧部）和CeM（中央杏仁核内侧部）显示出更多向vBNST CS-反应性细胞的投射，而vBNST摄食反应性细胞则接收更多来自vCA1（腹侧海马CA1区）、ZI（未定带）、PAG（导水管周围灰质）和NTS（孤束核）的投射。IC引起了作者的兴趣，因为它在恐惧记忆回忆期间被激活，并且在焦虑障碍中报告了功能改变。作者发现，投射到vBNST的IC神经元在CS+和CS-测试期间均表现出激活增加（图3C和3D）。通过全细胞记录验证了从IC到vBNST的单突触兴奋性连接的存在。电流钳记录显示，蓝光脉冲在感染AAV-ChR2(H134R)-EYFP的IC神经元中诱导了时间锁定的动作电位发放（图3E和3F）。短暂的光刺激vBNST中含有ChR2的IC末端，当膜电压保持在-70 mV时，在GABA能神经元中诱发了兴奋性突触后电流（eEPSCs）。这些eEPSCs被浴液中的河豚毒素（TTX）消除，并可以通过应用钾通道阻滞剂4-氨基吡啶（4-AP）恢复。此外，eEPSCs可以被AMPAR拮抗剂NBQX消除（图3G和3H）。
光遗传学抑制IC-vBNST回路可以减少对CS-测试的冻结水平，但对CS+测试没有影响（图3I-3K）。因此，作者的结果证实，IC中的谷氨酸能神经元与vBNST中的GABA能神经元建立了单突触连接，并且这些投射到vBNST的IC神经元在应对可预测或不可预测威胁信号时表现出高活性。
图3. IC的兴奋性投射到vBNST调节对不可预测威胁信号的反应
️3. CeL SOM⁺神经元的前馈抑制控制vBNST对不可预测威胁的反应
在CS⁺测试期间，vBNST可能通过其他传入神经元的前馈抑制进行调控。逆行示踪结果显示，CeL向vBNST中对CS⁻反应的细胞群发送投射。因此，作者推测在CS⁺测试期间，CeL可能对vBNST施加前馈抑制。作者针对投射到vBNST的CeL神经元，通过体内纤维光度法记录其Ca²⁺信号（图4A和4B）。投射到vBNST的CeL神经元的Ca²⁺信号仅在CS⁺测试中升高（图4C和4D）。
生长抑素（SOM）和蛋白激酶Cδ（PKCd）神经元是CeL中两种重要的GABA能抑制性神经元，它们大部分不重叠，代表功能不同的神经元。接下来，作者发现抑制CeLSOM-vBNST投射对CS⁺或CS⁻测试均无影响（图4G-4I）。人工激活CeLSOM-vBNST投射在未经过训练的小鼠中无法诱发僵硬行为，并且降低了对CS⁻的僵硬水平，但对CS⁺测试没有影响（图4J-4M）。激活CeLSOM-vlPAG投射可以在未经过训练的小鼠中诱发僵硬行为。抑制CeLSOM-vlPAG投射会损害CS⁺测试中的僵硬行为（图S5）。因此，CeL中特定的SOM⁺神经元亚群在CS⁺测试期间对vBNST施加前馈抑制。
图4. BNST投射的细胞神经元通过抑制性突触传递控制vBNST对不可预测威胁的反应
️4. vBNST-vlPAG和vBNST-CeM环路分别调控僵硬行为和焦虑样行为
vBNST中对不可预测威胁反应的神经元群激活会导致焦虑样行为，然而这些神经元群的下游效应尚不清楚。为了探究这一问题，作者进行了活动依赖性神经元顺行示踪实验，追踪vBNST中对条件刺激（CS⁻）反应的细胞和进食反应的细胞的输出。发现vBNST中CS⁻反应性细胞更倾向于向CeM、vlPAG和VTA发送投射，而vBNST中进食反应性细胞更倾向于向PVN、LH和NTS发送投射。作者通过光遗传学方法发现，人工激活vBNST中CS⁻反应性神经元群的下游靶点（vlPAG）可以诱导小鼠在新环境中或在旷场实验（OFT）中增加僵硬行为，而激活CeM则没有这种效果。相反，激活从vBNST中CS⁻反应性细胞到CeM的投射可以诱导焦虑样行为。激活vBNST中CS⁻反应性神经元群到CeM的信号通路对OFT中的总行进距离没有影响，这表明从vBNST中CS⁻反应性神经元群到CeM的环路可能有助于焦虑样行为，但与运动无关。因此，vBNST中CS⁻反应性神经元群通过不同的输出在应对不可预测威胁信号时发挥不同行为的作用。具体来说，vBNST-vlPAG环路有助于僵硬行为，而vBNST-CeM环路有助于焦虑样行为。
图5. vBNST中对CS⁻反应的神经元分别投射到腹侧导水管周围灰质和中央杏仁核，分别调节僵硬行为和焦虑样行为
️5. 针对vBNST环路的调控为焦虑症治疗提供了潜在方向
vBNST中CS⁻反应性神经元群在不可预测威胁诱导的焦虑中的生理作用尚不清楚。为了研究这一问题，作者在慢性不可预测应激（CUS）处理后记录了CS⁻反应性神经元群的活动。CUS组小鼠在旷场实验（OFT）和高架十字迷宫（EPM）测试中表现出更高的焦虑样行为（图S7E和S7F）。为了进一步研究vBNST中CS⁻反应性神经元群在焦虑样行为中的作用，作者进行了光遗传学实验。研究结果表明，抑制vBNST中CS⁻反应性神经元群可以缓解CUS处理小鼠的焦虑样行为（图S7G-S7I）。
此外，作者发现抑制vBNST-CeM环路可以改善在OFT和EPM测试中观察到的高焦虑样行为（图S7J-S7L）。因此，vBNST中CS⁻反应性神经元群的过度激活通过投射到CeM促进了CUS诱导的焦虑，而靶向vBNST中CS⁻诱导的神经元群可能是缓解焦虑行为的潜在策略。
️6. KCNQ3是通过稳定vBNST活动来治疗不可预测应激诱导焦虑的潜在靶点
vBNST对不可预测威胁反应的神经元群活动发生改变的分子机制尚不清楚。因此，作者采用磷酸化翻译核糖体亲和纯化（pTRAP）技术结合RNA测序，以鉴定vBNST对不可预测威胁反应的关键分子。作者通过qPCR验证了vBNST神经元中钾通道表达的下调，其中KCNQ3 mRNA的表达下调最为显著（图6D）。免疫荧光染色证实，与CS⁺测试相比，vBNST中GABA能神经元的KCNQ3表达在CS⁻测试中更低（图6E和6F）。
随后，通过Western blot实验研究了慢性不可预测应激（CUS）处理与KCNQ3表达之间的关系。CUS处理后KCNQ3蛋白和mRNA水平的下降（图6G-6I）。vBNST中CS⁻反应性神经元的内在兴奋性增加，且在脑片膜片钳记录中M型电流降低（图7A-7E）。在CUS处理后，小鼠在家庭笼中vBNST中CS⁻反应性神经元的活动增加被抑制，导致在vBNST中CS⁻反应性神经元中过表达KCNQ3后焦虑样行为的相应减少（图7F-7K）。将KCNQ家族通道的激动剂瑞替加滨注入vBNST可以减轻CUS处理后观察到的电生理和行为改变，以及不可预测应激后vBNST中CS⁻反应性神经元群的过度活跃和焦虑行为（图S12）。
图6. 在CS⁻测试和CUS处理后，KCNQ3水平的降低被识别出来
️结论
作者的研究阐明了调控不可预测威胁诱导焦虑的协同兴奋性和抑制性神经环路。vBNST中特定的GABA能神经元作为不可预测威胁信息汇聚和焦虑诱导的中心，而KCNQ通道在神经元兴奋性中发挥重要作用。本研究对于理解不可预测威胁诱导焦虑的神经环路以及识别不可预测应激后焦虑症治疗的潜在分子靶点具有重要意义。
️SA218型场景恐惧实验系统（FCS）用于小型啮齿类动物（大、小鼠）环境相关条件性恐惧实验研究。啮齿类动物在恐惧时会表现出特有的不动状态（immobility），动物在这种情况下倾向于保持静止不动的防御姿势。抗抑郁药和抗中枢兴奋药可以明显缩短不动状态持续的时间。实验过程中，实验对象被给与一个声音信号（条件刺激），随后给予电击（非条件）刺激。该训练称为条件性训练，训练结束后实验动物进行声音信号或环境联系性实验。一般情况下啮齿类动物对相应的环境和不同环境下同样的声音信号都会做出明显的条件性恐惧反应，如静止不动。这种测试可以在训练结束后立刻或几天后进行可以提供在条件信号影响下短期和长期记忆的信息。
