液相色谱中的干扰峰从何而来？
️1. 试剂/溶剂
在HPLC中，常用的试剂包括有机溶剂、各种盐和水。有机溶剂通常以色谱级形式购买，因此出现问题的几率相对较低。但是，已分配使用并反复暴露的有机溶剂具有更高的污染风险，从而增加了干扰峰的可能性。
其中，水是干扰峰的主要来源之一，这个问题经常被人们忽视。对于涉及低波长的检测方法，建议使用高质量的水，以避免水中杂质带来的诸多问题。此外，各种盐也会导致色谱干扰。例如，如图2所示，与图1相比，图2中添加了磷酸二氢钾，导致在16.5分钟处出现干扰峰。无机盐引起的干扰峰一般在方法开发阶段就得到解决，并寻求解决方案。一旦方法建立，盐的种类和等级也会确定，因此盐对方法的影响在很大程度上是可控的。
对于水、无机盐等干扰峰的快速解决方法是安装鬼峰捕获柱，可以有效防止此类干扰。若使用离子对试剂，应选择不影响离子对试剂的鬼峰捕获柱。
️02.设备
第二个干扰峰来源来自于流动相制备和样品预处理过程中所使用的各种设备。
首先，流动相制备时使用到的设备，包括烧杯、玻璃棒、pH计、滤杯、滤膜、流动相瓶等。烧杯和玻璃棒是与流动相接触最先的设备，因此建议使用专用的烧杯和玻璃棒进行流动相制备。滤杯只要经过实验室人员的彻底清洗，一般不会引入污染。但如果过滤含有离子对试剂的流动相，建议增加清洗次数，避免后续流动相受到污染。因此，应建立滤杯的基本清洗程序，确保实验室人员使用的设备得到妥善清洗。滤膜也是干扰峰的一个来源。
如图3所示，乙腈经过有机体系滤膜过滤后，在梯度洗脱时会引入明显的干扰峰。由于色谱级试剂已经经过过滤，且多数仪器都配有脱气装置，因此不建议再过滤甲醇或乙腈等纯有机相。流动相瓶引入干扰峰主要发生在夏季，因为夏季气温较高，纯水相容易滋生细菌，如果流动相瓶使用后清洗不当，也有可能引入干扰峰。因此，必须建立严格的流动相瓶清洗程序。
其次，样品前处理过程中所使用的设备。样品前处理过程中与样品接触的设备主要有容量瓶、滤头、注射器和样品瓶。容量瓶的清洗应遵循与流动相瓶和过滤装置相同的程序，并制定适当的清洗方案。移液器、滤头和注射器大多为塑料，化学惰性不如玻璃器皿，更容易引入干扰峰。如图4、5和6所示，该方法在210nm波长处检测，溶剂为正己烷和异丙醇混合物（90:10），溶剂分别与移液器头、一次性移液器和一次性注射器接触后引入了不同的干扰峰。如果样品瓶只使用一次，一般不会引入干扰峰。但如果清洗后多次重复使用，则应建立清洗程序，并验证清洗的有效性。
03. HPLC 系统
相较于前两类，HPLC 系统的干扰峰的解决更具挑战性。HPLC 系统是动态的，因此解决这些问题可能非常耗时，并且需要实验者具备很高的色谱专业知识。这些问题主要可归因于三个因素：强保留物质、离子对污染和系统中的细菌生长。
首先，强保留物质的干扰表现为峰宽。该问题多发生在等度洗脱过程中，而在梯度洗脱过程中，它通常出现在高有机相中。这是因为强保留物质在当前进样中没有洗脱出来，而是被带入后续进样中，如图7中9分钟处的色谱峰所示。这些干扰峰可以通过延长收集时间或增加洗脱强度来消除，以防止干扰后续样品。
系统干扰峰的第二个方面是 HPLC 系统被离子对试剂或螯合剂等难洗脱试剂污染。这种污染通常是由于使用含有离子对试剂或螯合剂的流动相后系统清洗不彻底造成的。这些污染物主要干扰使用较低检测波长的方法，通常表现为基线噪音增加或干扰峰增加，但随着方法的进展，系统趋于稳定。系统干扰峰的第三个方面是系统中的细菌生长。许多读者可能会对此感到惊讶，因为系统通常在使用后用有机溶剂冲洗和储存。然而，在许多方法中，流动相 A 是水基溶液，虽然水相是每天新鲜制备的，但如果从滤头到比例阀的管道长时间保持在水相中，细菌就会生长。随着时间的推移，这会导致在梯度洗脱过程中干扰峰逐渐出现。虽然这个问题有些隐蔽，但每天结束时用有机溶剂冲洗含有纯水的通道相对容易解决。
色谱人员在实践中面临的最大挑战是如何识别和确定干扰峰的来源。如果不能找到问题的根本原因，就很难制定有针对性的解决方案。
