文献分享丨PEG与精氨酸：抗体纯化中去除聚集体的得力助手

在生物制药领域，抗体药物的生产过程中，抗体聚体的形成一直是困扰研发人员的难题。聚体不仅会降低药物的疗效，还可能引发免疫反应，严重影响药物的安全性和有效性。

今天，博格隆给大家分享一篇关于不同层析填料去除抗体聚体能力的研究，希望能为大家提供一些有益的参考。

抗体聚体的形成通常与抗体分子的疏水区域暴露、二硫键异构化和分子间结构域交换有关。这些聚体在细胞培养收获物中含量较高，不仅降低抗体药物的生物活性，还可能引发免疫反应。鉴于这些聚体难以通过传统的纯化方法完全去除，因此开发高效的聚体去除方法，对于提高抗体药物的质量至关重要。

️实验过程

在这项研究中，研究人员选取了八种不同类型的层析填料，包括疏水相互作用（HIC）层析填料、羟基磷灰石（HA）层析填料和混合模式层析填料，对一种在CHO细胞中表达的单克隆抗体（mAb）进行聚体去除测试。

实验中，首先使用Protein A和阴离子交换（AEX）层析法对抗体进行初步纯化，得到含有约14%聚体的中间产物。随后，分别在不同的层析条件下，对这些层析填料的聚体去除能力进行评估。

️实验方法

️● 层析柱：所有填料都装在直径为0.66cm、床高为15cm的柱子中。使用不同的缓冲液配方进行层析实验。

️● 分析方法：SEC-HPLC，所有样品使用Tosoh TSKgel G3000SWXL不锈钢柱进行分析，上样量100μg样品，流速为1.0mL/min，流动相为50mM磷酸钠和300mM氯化钠，pH6.8。

️疏水相互作用层析（HIC）

在上样样品中添加高浓度盐，使聚体结合，而单体流穿（FT）。聚体水平在FT中降低至1%以下，表明HIC层析在去除聚体方面具有很高的效率。

对于疏水层析，即便配基相同，不同材质的疏水填料也可能具有不同的疏水表现，样品结合的盐浓度需求也可能不同。因此，需要针对不同的样品选择合适的结合和洗脱条件以期达到理想的聚体分离效果。

️羟基磷灰石（HA）层析

对该实验中的mAb进行羟基磷灰石填料结合-洗脱模式纯化，结果显示使用钠盐梯度洗脱，比磷酸盐梯度洗脱效果更好。

在洗脱缓冲液中添加PEG，可以显著提高分离效果。这表明PEG的添加可以增强聚体的柱上保留，从而实现更好的分离。

️混合模式层析

使用高分辨率的阳离子混合模式层析填料在pH5.5下进行结合洗脱模式纯化，使用盐梯度线性洗脱，可以实现高纯度的单体洗脱，但洗脱峰有拖尾现象。使用精氨酸梯度洗脱可以改善分离效果。这表明精氨酸可以有效破坏聚体与层析填料的相互作用，从而提高分离效果。

采用同种配基，粒径较大的阳离子混合模式层析填料在相同条件下，分离效果不如前一种，但添加PEG可以提高分离效果。这表明PEG的添加可以增强聚体的保留，从而实现更好的分离。

采用强阴离子混合模式层析填料在pH7.0下运行，使用线性精氨酸梯度洗脱，可以实现高纯度的单体洗脱，但洗脱峰尾部纯度较低。添加PEG可以提高洗脱液纯度，但会增加洗脱体积。最终，使用步阶精氨酸洗脱和调整合适的PEG梯度可以实现单体高纯度和小洗脱体积。

️阳离子交换层析（CEX）

在典型线性盐梯度层析条件下，CEX层析无法有效分离单体和聚体。但在洗脱缓冲液中添加PEG，可以显著提高分离效果，使单体和聚体完全分离，且通过进一步开发分步洗脱方法保持产品质量和收率。这表明PEG的添加可以显著提高CEX层析的分离效果。

️多种层析填料的有效性

HIC和HA填料在去除聚体方面表现出强大的能力。混合模式层析填料也显示出良好的聚体去除效果。

️PEG和精氨酸的显著作用

在纯化过程中添加PEG和/或精氨酸可以显著提高分离效果，尤其是在CEX层析中，PEG的添加可使单体和聚体完全分离。

️操作参数的优化

对于每种填料，需要通过实验确定最佳的操作参数，以实现最大的聚体清除和单体回收率。在大规模生产中，步阶洗脱比线性梯度洗脱更有利于减少处理时间和洗脱体积。

在抗体聚体去除方面，选择合适的层析填料至关重要。无论您是进行基础研究还是工业化生产，博格隆的填料都能为您提供可靠的解决方案。

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️参考文献

[1] Zhang X, Chen T, Li Y. A parallel demonstration of different resins' antibody aggregate removing capability by a case study. Protein Expression and Purification. 2019;153:59-69. DOI: 10.1016/j.pep.2018.08.011.

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