小分子多肽合成方法的改进

摘要：采用三苯氯甲烷替代三苯甲醇 , 以 BF3· Et2 O作为催化剂保护巯基 , 产率明显提高 (72 %～ 95% ) ;采用乙腈的水溶液作为反应体系 , 控制投料温度 , 活泼酯与氨基酸能顺利结合 , 产率普遍达到 85% , 节省了原料 , 并大大简化了实验操作 .利用上述改进方法成功地合成了有潜在药用前景的新手性小分子多肽 , 其结构得到了严格的谱学鉴定 , 经过了 IR, !HNMR, 1 3CNMR, MS或元素分析的确证 .

️关键词： 三苯氯甲烷 活泼酯 氨基酸 手性小分子多肽

多肽作为生物体内的重要组成部分之一, 在体内各脏器有许多复杂而特殊的生理活性。研究和挖掘多肽 (尤其是人工合成的小分子多肽) 与体内各种脏器的特殊生理作用, 可以提供许多预防和治疗人类疾病的有效方法。因此, 多肽类药物不断涌现 [1-5] , 引起了化学家、生物学家和医学家的广泛关注。众所周知, 合成多肽的方法因其原料昂贵, 产率低且不易提纯, 给研究者带来不少困难, 因此有必要对多肽的合成方法进行不断简化和改进。1995年, Capretta等人 [6] 用三苯甲醇在BF3·Et2O催化下保护巯基乙酸, 产率72%。本文采用三苯氯甲烷代替三苯甲醇, 仍以BF3·Et2O做催化剂, 产率可提高到95%。文献调研表明, 小分子多肽的合成多采用N-羟基琥珀酰亚胺的活泼酯的液相合成法 [7-10] , 用乙醇水溶液作为反应体系, 活泼酯大大过量, 柱层析后得到产率并不理想的目标产物。本文采用乙腈水溶液作为反应体系, 控制最佳投料温度, 成功地实现了对活泼酯和氨基酸反应的改进。并在此基础上简单而顺利地合成了几种具有潜在放射性药用前景的手性小分子多肽。合成路线见图1。

图1 手性小分子多肽的合成路线

️1.1 巯基的保护

据文献记载, 巯基乙酸可以用三苯甲醇在路易斯酸催化下保护巯基。三苯甲醇在路易斯酸催化作用下形成三苯甲醇碳正离子, 属于典型的Sn1亲核取代反应。根据其机制, 我们采用三苯氯甲烷代替三苯甲醇, 同样以BF3·Et2O作为催化剂, 在三氯甲烷溶剂中得到大量的固体, 产率明显提高, 由原来的72%增加到现在的95%以上。但此方法的缺点是过量的三苯氯甲烷在后处理时易水解生成三苯甲醇, 这是产品中副产品的主要来源。产物可以用甲苯重结晶进一步提纯, 谱学特征与文献[6]吻合。

️1.2 小分子多肽的合成

第2步与第4步均属于羧基的活化反应, 其方法与文献[7]相同。其中第4步羧基活化产物考虑到产率较高, 且不稳定, 故未完全纯化直接连续反应, 实践证明此法是可行的。

第3步反应涉及活泼酯与氨基酸的耦合反应。乙醇的水溶液作为反应体系回流若干小时是大量文献采用的合成方法。此法需要大过量的活泼酯, 产物必须经过柱层析提纯, 产率仅在50%左右。而我们采用乙腈的碱性水溶液作为反应体系, 控制投料温度在40～50 ℃间, 结果显示了以下几个改进:活泼酯3与胺按摩尔比1∶1投料, 节省了活泼酯;产率明显提高, 普遍达到85%以上;产物只需重结晶便可提纯, 大大简化了实验操作。故实验改进获得了较满意的成功。分析可能原因是在碱性水体系中, 氨基酸溶解性增大, 亲核性增强, 而活泼酯的稳定性并未受到明显限制, 故反应能顺利进行。

化合物4的IR在3 340 cm-1为NH吸收峰, 2 500～3 300 cm-1为宽峰, 且1 740和1 720 cm-1有羧羰基吸收峰, 形状为肩峰。在1 640 和1 540 cm-1还有明显的酰胺键Ⅰ带和Ⅱ带特征吸收峰, 其他化合物也有类似吸收。1HNMR中, SCH2的2个氢由于同碳耦合显示2组双重峰, 耦合常数为13.3 Hz。而相反在化合物5中, SCH2为单峰, PhCH2在3.00左右由于同碳耦合和邻碳耦合形成2组四重峰, 耦合常数为13.7和4.9 Hz。在化合物10中, 同样SCH2为单峰, PhCH2由于同碳耦合和邻碳耦合出现2组四重峰, 耦合常数为13.3和4.4 Hz, 其他氢均得到严格归属。化合物10的质谱 (EI法) 虽未给出分子离子峰, 但可以看出许多明显的碎片峰:550.3 (—CH2CH3, 0.4) ;502.0 (—Ph, 0.3) ;486.3 (—PhCH2, 0.3) ;243.2 (C19H+ 15, 71) ;116.1 (C13H+ 10, 58) ;91.2 (C7H+ 7, 50) ;77.1 (C6H+ 6, 21) 。所有的新化合物元素分析误差均在0.3%以内。

️2.1 手性小分子多肽的合成

️2.1.1 巯基的保护

在50 mL的单口烧瓶中分别加入重蒸的巯基乙酸 (0.01 mol) 和二氯甲烷 (6 mL) 及冰醋酸 (6 mL) 混合溶液, 加入TrCl (0.01 mol) , 充分搅拌, 再加入BF3·Et2O溶液2 mL, 在室温下搅拌1 h, 有大量的沉淀生成。旋去二氯甲烷, 再加入10 mL水以除去BF3·Et2O, 过滤收集固体, 分别用水 (3×10 mL) 、CH3CN (5 mL) 和冰乙醚 (2 mL) 洗涤, 得到3.2 g化合物2, 产率96%。在苯中重结晶, 得到无色晶体。θ mp为159～160 ℃;IR (KBr) ν/cm-1∶3 000 (s) , 1 700 (s) , 1 600 (s) , 1 490, 1 445 (m) ;与文献[6]的值相符。

️2.1.2 羧基的第1次活化

在20 mL三口烧瓶上装上配有干燥管的冷凝管和温度计, 搅拌下加入TrCH2COOH (3 mmol) 和NHS (3 mmol) 的无水THF溶液4 mL, 冰盐浴冷却至-5～0 ℃, 10 min后, 逐渐加入DCC (3 mL) 的无水THF (3 mL) 溶液, 然后维持-5～0 ℃反应2 h, 有大量白色沉淀生成, 继续在室温下搅拌16 h或过夜, 停止反应, 滤掉沉淀, 用冷CH2Cl2充分洗涤, 旋蒸掉溶剂的粗产品在乙酸乙酯中重结晶, 得到无色棱状晶体1.10 g, 为化合物3。其产率91%;θ mp为177.5～178.3 ℃;IR (KBr) ν/cm-1∶3 070 (w) , 2 940, 2 860 (w) , 1 820, 1 790, 1 745 (特征酯) , 1 630, 1 580, 1 495, 1 445;与文献[7]的值吻合。

️2.1.3 化合物4和5的合成

在装有冷凝管和搅拌装置的500 mL单口烧瓶中, 加入活泼酯 (0.012 mol) 和250 mL乙腈, 搅拌溶解后缓慢升高温度。控制在50～60 ℃间, 缓慢加入氨基酸 (缬氨酸或苯丙氨酸, 0.012 mol) 的0.2 mol·L-1 NaOH溶液, 然后回流2 h, TLC跟踪原料消失, 停止反应。 溶液成中性, 冰浴后用稀H2SO4调节pH值约为3, 晶体析出又溶解, 此时分出水相, 有机相用强酸酸化, 得到白色沉淀, 过滤收集, 在乙酸乙酯中重结晶, 可得纯的化合物4或5。

化合物4:取化合物3 (5 g, 0.012 mol) 与缬氨酸 (1.403 g, 0.001 2 mol) 进行反应, 在乙酸乙酯中重结晶, 得化合物4 (无色针状晶体) 4.40 g, 产率85.0%。其θ mp为148.0～149.0 ℃。元素分析, C26H27NO3S, w/%:计算值为C 72.03, , H 6.28, N 3.23;实验值为C72.12, H 6.39, N 3.58。IR (KBr) ν/cm-1:3 340 (s) , 3 100～2 500 (w) , 1 740, 1 720, 1 638, 1 543, 1 500, 1 220, 760, 740, 700。1HNMR (300 MHz, DMSO) δ:12.65 (1H, br, COOH) , 8.16 (1H, d, J=8.3 Hz, NH) , 7.25～7.37 (15H, m, Ar) , 4.07 (1H, q, J 1=5.9 Hz, J 2=8.3 Hz, CH) , 2.93 (1H, d, J=13.3 Hz, SCH) , 2.85 (1H, d, J=13.3 Hz, SCH) , 2.01 (1H, m, J=6.5 Hz, CH) , 0.83～0.85 (6H, d, J=6.4 Hz, 2CH3) 。

化合物5: 取化合物3 (5 g, 0.012 mol) 与苯丙氨酸 1.91 g (0.001 2 mol) 进行反应, 在乙酸乙酯中重结晶, 得化合物5 (白色晶体) 5.1 g, 产率91.0%, θ mp为149.0～143.2 ℃。元素分析, C30H27NO3S, w/%:计算值为C 74.82, H 5.65, N 2.91;实验值为C 75.01, H 5.54, N 3.09。IR (KBr) ν/cm-1: 3 350 (s) , 3 100～2 500 (w) , 1 740, 1 640, 1 540, 1 500, 1 220, 770, 730, 705。1HNMR (300 MHz, DMSO) δ:11.50 (1H, br, COOH) , 8.33 (1H, d, J=7.8 Hz, NH) , 7.20～7.35 (20H, m, Ar) , 4.34 (1H, m, CH) , 3.00 (1H, q, J 1=4.9 Hz, J 2=13.7 Hz, PhCH) , 2.81 (1H, q, J 1=4.9 Hz, J 2=13.7 Hz, PhCH) , 2.75 (2H, s, SCH2) 。

️2.1.4 化合物4或5的羧基活化

在配备有温度计、冷凝管 (加干燥管) 和搅拌器的25 mL三口烧瓶中加入2 mmol化合物4或5, NHS (2 mmol) 和无水THF (7.0 mL) , 室温下搅拌10 min, 冰浴把温度降低至0～5 ℃, 加入DCC (2 mmol) 的无水THF (4 mL) 溶液, 出现白色沉淀, 然后维持0～5 ℃继续反应2 h, 搅拌过夜, TLC跟踪, 表示原料已经消失, 停止反应。过滤旋干, 用乙醚研制后, 用大量水洗涤, 然后真空烘干得化合物A或B。

化合物A:化合物4与NHS反应, 得化合物A (白色粉末) 1.09 g, 产率89.0%, θ mp为62 ℃左右。IR显示在1 820, 1 780, 1 740 cm-1处有特征酯吸收峰。

化合物B:化合物5与NHS反应, 得化合物B (白色粉末) 1.00 g, 产率83.3%, θ mp为60 ℃左右。IR显示在1 815, 1 785, 1 740 cm-1处有特征酯吸收峰。

️2.1.5 目标产物6～10的合成

在配备冷凝管和搅拌器的100 mL单口烧瓶中, 加入活泼酯A或B (2.8 mmol) 和60 mL乙腈, 然后升高温度至40 ℃左右, 缓慢加入二胺 (14 mmol) 的溶液, 加热回流2 h, TLC跟踪反应, 原料消失, 溶液呈碱性, 旋去大部分乙腈, 加入水稀释, 再用1 mol·L-1 NaOH溶液调节pH为13左右, 有大量白色沉淀产生, 收集固体。可通过重结晶或柱层析纯化, 产率80%～90%。

化合物6:化合物A与GlyGly进行反应, 在体积比为1∶1的乙醇水溶液中重结晶, 得到白色固体化合物6。其产率77%, θ mp为129.0～131.2 ℃。元素分析, C30H33N3O5S, ω/%:计算值为C 65.79, H 6.07, N 7.67;实验值:C 65.85, H 5.59, N 7.73。IR (KBr) ν/cm-1:3 250 (br) , 3 100～2 500, 1 720, 1 640, 1 540, 1 500, 740, 700。1HNMR (300 MHz, DMSO) δ:12.50 (1H, br, COOH) , 8.25 (1H, t, NH) , 8.08 (2H, t, 2NH) , 7.23～7.36 (15H, m, Ar) , 4.10 (1H, t, CH) , 3.79 (4H, d, 2NCH2) , 2.93 (1H, d, J=13.4 Hz, SCH) , 2.85 (1H, d, J=13.4 Hz, SCH) , 1.94 (1H, m, CH) , 0.82 (6H, d, 2CH3) 。

化合物7:A与N, N-二甲基乙二胺反应, 在乙酸乙酯中重结晶, 得1.21 g无色晶体, 为化合物7。其产率86%, θ mp为190.0～191.1 ℃。元素分析, C30H37N3O2S, w/%:计算值为C 71.54, H 7.40, N 8.34;实验值为C 71.26, H 7.62, N 8.60。IR (KBr) ν/cm-1:3 300 (br) , 3 050, 2 750～2 800 (br) , 1 640, 1 560, 1 040, 780, 740, 710。1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ:7.20～7.40 (15H, m, Ar) , 6.56 (1H, d, J=8.2 Hz, NH) , 6.31 (1H, br, NH) , 4.04 (1H, q, J 1=8.6 Hz, J 2=7.3 Hz, CH) , 3.30 (2H, m, CH2) , 3.04 (2H, s, SCH2) , 2.21 (6H, s, 2NCH3) , 1.96 (1H, m, CH) , 0.85 (6H, d, 2CH3) 。

化合物8:A与N, N-二乙基乙二胺反应, 在乙酸乙酯中反复重结晶, 可得到纯化合物8。其产率80%, θ mp为165.0～166.1 ℃ (部分分解) 。元素分析, C34H41N3O2S, w/%:计算值为C 72.28, H 7.77, N 7.90;实验值为C 72.74, H 8.03, N 8.25。IR (KBr) ν/cm-1:3 250 (br) , 3 050, 2 800～2 950 (br) , 1 640, 1 560, 740, 700;1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ:8.30 (1H, br, NH) , 7.41～7.20 (15H, m, Ar) , 6.65 (1H, d, J=6.7 Hz, NH) , 3.98 (1H, m, CH) , 3.64 (2H, m, CH2) , 3.39 (1H, d, J=15.4 Hz, SCH) , 3.17～3.07 (7H, m, 3NCH2+SCH) , 2.05 (1H, m, CH) , 1.36 (6H, 2CH3) , 0.89 (6H, m, 2CH3) 。

化合物9:B与N, N-二甲基乙二胺反应, 在乙酸乙酯中重结晶, 得无色晶体1.27 g, 为化合物9。其产率88.9%, θ mp为123.0～124.0 ℃。元素分析, C34H37N3O2S, w/%:计算值为C 74.01, H 6.76, N 7.62;实验值为C 73.67, H 6.69, N 7.36。IR (KBr) ν/cm-1:3 250 (br) , 3 220, 2 780～2 980 (br) , 1 620 (s) , 1 540, 740, 700。1HNMR (500 MHz, CDCl3) δ:7.51～7.21 (20H, m, Ar) , 6.75 (1H, d, J=6.7 Hz, NH) , 6.70 (1H, m, NH) , 4.29 (1H, m, CH) , 3.31 (2H, m, NCH2) , 3.20 (1H, d, J=15.8 Hz, SCH) , 3.00 (1H, d, J=15.8 Hz, SCH) , 2.93 (2H, m, PhCH2) , 2.52 (2H, m, NCH2) , 2.31 (6H, s, 2NCH3) 。13CNMR (500 MHz, CDCl3) δ:170.53 (CO) , 168.49 (CO) , 144.44～127.37 (Ar, 24C) , 68.22 (CPh3) , 57.74 (NHCH) , 55.56 (NHCH2) , 45.20 (NCH3) , 39.05 (NCH2) , 36.76 (PhCH2) , 36.64 (SCH2) 。

化合物10:B与N, N-二乙基乙二胺反应, 梯度柱层析分离提纯, 得化合物10, 为白色晶体。其产率78.9%, θ mp为108.9～109.7 ℃。元素分析, C36H41N3O2S, w/%:计算值为C 74.58, H 7.13, N 7.25;实验值为C 75.87, H 7.32, N 7.35。IR (KBr) ν/cm-1:3 280 (br) , 3 060 (m) , 2 980～2 840 (br) , 1 650, 1 560, 740, 700。1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ:7.27～7.02 (20H, m, Ar) , 6.60 (1H, d, J=7.4 Hz, NH) , 5.84 (1H, m, NH) , 4.19 (1H, m, CH) , 3.02 (2H, m, NCH2) , 2.93 (2H, s, SCH2) , 2.81 (1H, q, J 1=5.4 Hz, J 2=13.3 Hz, PhCH) , 2.65 (1H, q, J 1=5.4 Hz, J 2=13.3 Hz, PhCH) , 2.27 (4H, q, 2NCH2) , 2.19 (2H, m, J=7.1 Hz, NCH2) , 0.75 (6H, t, J=7.1 Hz, 2CH3) 。13CNMR (300 MHz, CDCl3) δ:169.7 (CO) , 167.8 (CO) , 126.9～143.9 (24C, Ar) , 67.8 (CPh3) , 55.1 (NHCH) , 55.6 (NHCH2) , 46.2 (NCH2) , 38.7 (NCH2) , 36.6 (PhCH2) , 36.1 (SCH2) , 11.4 (2CH3) 。MS (EI法) (m/Z) /%:579.5 (M+1, 0.4) , 550.3 (—C2H5, 0.4) , 502.0 (—Ph, 0.3) , 486.3 (—PhCH2, 0.3) , 243.2 (C19H+ 15, 71) , 166.1 (C13H+ 10, 58) , 91.2 (C7H+ 7, 50) , 77.1 (C6H+ 6, 21) 。

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