DageMTI IR-1000摄像机用于记录成年小鼠腰椎运动神经元的体外脊髓切片制备

️ 一、简介

中枢神经系统切片标本在电生理学研究中的发展，极大地推动了人们对健康和疾病状态下神经元特性的认知。然而，对这些标本中脊髓运动神经元的研究，在很大程度上局限于出生后的早期阶段，因为成年运动神经元在制作标本的过程中容易受到损伤。因此，我们试图开发一种成年脊髓切片标本制备方法，以便能够对腰段运动神经元进行记录。为了实现这一目标，我们通过实验优化了制备过程中使用的溶液成分，以减少能量衰竭、降低有害的离子流动、减轻氧化应激，并防止兴奋性毒性导致的细胞死亡。除了其他添加剂外，这还包括使用丙酮酸乙酯，它是一种有效的营养物质和抗氧化剂。我们还优化并采用了许多先前已发表的针对其他体外标本制备的改良方法，例如使用聚乙二醇。我们详细描述了制备方案，并讨论了每一项改良背后的原理。通过使用这个方案，我们从成年切片中已鉴定的荧光蛋白标记的运动神经元上获得了稳定的全细胞膜片钳记录；在此，我们描述了这些成年运动神经元的放电特性。我们认为，这种制备方法将有助于进一步研究运动神经元如何整合活动以产生成年动物的运动行为，以及诸如肌萎缩侧索硬化症等病理过程如何影响这些神经元。

️东莞富临医疗科技有限公司是Dage-MTI在亚洲的代理商，富临医疗为亚洲客户提供“红外摄像机”与“光电生理产品”

自从 Henry McIlwain 的开创性工作以来，脑切片标本已成为研究细胞神经生理学相关问题的重要工具。这些简化的标本相较于在体标本具有一些优势，因为在记录反应时不受麻醉剂的影响，同时局部功能性突触回路可能得以保留。更重要的是，它们能够让研究者很好地接触并记录已鉴定的神经元群体，同时还能控制外部环境。这使得可以以确定的浓度灌流药物和其他试剂，这对于所研究细胞的药理学 / 生理学特性表征可能至关重要。此外，对于使用细胞内电极的研究而言，这些标本还有一个优势，即由于不存在任何心脏或呼吸运动，它们在机械稳定性方面表现更佳。另一方面，切片标本也存在某些缺点，尤其是对于脊髓的研究来说，由于制备出能使成年神经元存活的标本存在挑战，所以需要使用新生动物的组织。

脊髓运动神经元（MNs）作为脊髓所有运动输出的 “最后共同通路”，已经在运动生理学方面得到了研究，并且也被用作研究细胞神经生理学的经典模型。从历史上看，对脊髓运动神经元的记录，以往是通过对麻醉或去脑的猫进行尖锐微电极记录来实现的。随着基因技术的出现，研究方向逐渐转向使用小鼠作为实验模型。与此相符的是，最近有一些成功的尝试，能够在成年啮齿动物体内对运动神经元进行微电极记录。然而，在体外对成年脊髓运动神经元进行记录仍然是一个挑战。这在很大程度上是因为它们对缺血很敏感，而在制备体外标本的过程中缺血是不可避免的。这种脆弱性可能与这些细胞的高代谢需求和低钙缓冲能力有关。此外，人们还观察到，运动神经元体积较大，其树突可能向外延伸达 1 毫米或更长 ，这使得它们在切片过程中，由于其突起被横断而更容易受到损伤。

鉴于这些困难，研究运动神经元的科学家们在很大程度上局限于使用出生后前两周（至出生后第 15 天）动物的脊髓切片。这些年幼的动物对缺氧更具抵抗力，并且髓鞘化程度较低，这使得组织更柔软，对氧气的通透性更高，因此对制备过程中造成的损伤耐受性更强。然而，随着出生后的发育成熟，运动神经元以及脊髓中其他细胞的形态和组成离子通道都发生了明显变化。因此，尽管来自年幼年龄组的生理数据非常有用，但不一定能外推到年龄较大的个体。此外，影响运动神经元的疾病，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）是成年后发病的疾病。尽管在肌萎缩侧索硬化症的小鼠模型中已经观察到运动神经元生理学的一些早期变化，但为了全面了解疾病过程中发生的生理变化，有必要研究出生后不同阶段的运动神经元。

过去，科学家们曾多次尝试开发一种可行的成年体外脊髓标本制备方法，以便对运动神经元进行记录，并且取得了不同程度的成功。最近在这方面的一次成功尝试是由 Carp 等人进行的，他们在制备大鼠脊髓切片时，使用聚乙二醇（PEG）来减轻切片过程中广泛的膜横断所带来的影响，并使用尖锐微电极对 6 至 12 周龄大鼠中推测的运动神经元进行了细胞内记录。然而，很少有关于对出生后 15 天以上的小鼠腰段运动神经元进行记录的报道，这可能是因为制备和记录条件尚未得到优化。通过对用于大鼠记录的溶液进行调整，最近有报道称在分离的小鼠骶段脊髓标本中，成功地对骶段运动神经元进行了尖锐电极记录。这表明，使用膜片钳技术对成年小鼠腰段运动神经元进行切片记录应该是可行的。

为了确定特定神经元群体的特性，最近人们使用了转基因小鼠，在这些小鼠中，荧光蛋白在基因上已定义的神经元中表达。为了研究这些已界定的细胞类群的生理学特性，研究者必须能够在视觉控制下识别并记录这些细胞。因此，全细胞膜片钳技术已成为此类电生理学研究的首选方法。与尖锐微电极记录相比，全细胞技术具有更高的分辨率、更低的噪声，并且在确定输入电阻和膜时间常数等电参数方面更加可靠。

在本文中，我们描述了一种制备成年小鼠腰段脊髓可行切片的方案，该方案允许对运动神经元进行全细胞记录。在纳入某些新的改良方法的同时，我们的方法在很大程度上是兼收并蓄的，采用了其他研究者在各种体外标本制备中使用的许多已发表的神经保护操作方法。这在很大程度上意味着，该方法依赖于优化制备过程中使用的溶液设计，以增强其神经保护特性。我们深入描述了这个通过实验优化的制备程序，并提供了构成该过程的各个步骤背后的原理。

️ 二、材料与方法

️01. 溶液

用于记录的人工脑脊液（aCSF），即记录用人工脑脊液（RaCSF），其成分（以毫摩尔每升计）为：121 氯化钠（NaCl）、3 氯化钾（KCl）、1.25 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）、25 碳酸氢钠（NaHCO₃）、1.1 氯化镁（MgCl₂）、2.2 氯化钙（CaCl₂）、15 葡萄糖（dextrose）、1（+）- 抗坏血酸钠（sodium l-ascorbate）、5 丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate）和 3 肌醇（myo-inositol）。该溶液的 pH 值约为 7.4 [在 95% 氧气（O₂） - 5% 二氧化碳（CO₂）（混合气体）适度鼓泡的情况下为 7.3 至 7.4]，渗透压为 310 毫渗摩尔每千克水（mosmol/kgH₂O）（范围为 305 - 315 mosmol/kgH₂O）。

解剖用人工脑脊液（DaCSF）的成分（以毫摩尔每升计）为：191 蔗糖（sucrose）、0.75 葡萄糖酸钾（K-gluconate）、1.25 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、26 碳酸氢胆碱（choline bicarbonate）（80% 溶液）、4 硫酸镁（MgSO₄）、1 氯化钙（CaCl₂）、20 葡萄糖（dextrose）、2 犬尿烯酸钠盐、1（+）- 抗坏血酸钠（sodium l-ascorbate）、5 丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate）和 3 肌醇（myo-inositol）。该溶液的 pH 值约为 7.3（在混合气体剧烈鼓泡的情况下为 7.2 至 7.3），渗透压为 310 毫渗摩尔每千克水（mosmol/kgH₂O）（范围为 305 - 315 mosmol/kgH₂O）。为确保充分的氧合作用和合适的 pH 值调节，所有碳酸氢盐缓冲溶液在使用前至少用混合气体鼓泡 0.5 小时，并且在使用过程中持续鼓泡。上述两种溶液均用蒸馏水配制，二价离子最后添加，以避免沉淀，只有在溶液体积接近最终体积且通过用混合气体鼓泡至少 10 分钟大致调节好 pH 值之后才添加。DaCSF 被冷却并始终保存在冰上。DaCSF 和 RaCSF 溶液均在使用当天新鲜配制。这一点使得整个过程更加繁琐，但科学家们想强调的是，注意到，当使用冷藏过夜的溶液制备切片时，获得的标记细胞的数量和质量明显下降。

细胞内电极液的成分如下（以毫摩尔每升计）：131 甲磺酸钾（K-methanesulfonate）、6 氯化钠（NaCl）、0.1 氯化钙（CaCl₂）、1.1 乙二醇双（2 - 氨基乙醚）四乙酸钾（EGTA-KOH）、10 羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、0.3 氯化镁（MgCl₂）、3 三磷酸腺苷镁盐（ATP-Mg²⁺ salt）、0.5 三磷酸鸟苷钠盐（GTP-Na⁺ salt）、2.5 还原型谷胱甘肽（l-glutathione reduced）和 5 磷酸肌酸二（三羟甲基氨基甲烷）盐（phosphocreatine di (tris) salt）。用氢氧化钾（KOH）将溶液的 pH 值调节至 7.25（约添加 10 - 15 毫摩尔每升的钾离子），渗透压范围为 295 - 300 毫渗摩尔每千克水（mosmol/kgH₂O）。该溶液用超纯水（Milli-Q water）配制，分装后储存在零下 20 摄氏度。使用时将其解冻，通过 0.2 微米的滤器过滤，并在使用过程中保存在冰上。这种溶液的设计主要是为了模拟细胞内环境，当与 RaCSF 一起使用并假设与细胞内容物完全交换时，可提供 - 98 毫伏的钾离子平衡电位（EK）、 - 75 毫伏的氯离子平衡电位（ECl）、 + 79 毫伏的钠离子平衡电位（ENa），以及 10 纳摩尔（nM）范围内的游离钙离子浓度 。该溶液与 RaCSF 的液接电位约为 8 毫伏。特别是在使用成熟组织时，所有细胞外溶液具有相似的渗透压值至关重要，以避免组织受到任何渗透压冲击。细胞内溶液的渗透压保持略低，以提高记录的稳定性。

️02. 动物与组织制备

所有动物实验程序均经相关委员会批准，并符合相关标准。鉴于脊髓运动神经元是胆碱能神经元，科学家们使用了在胆碱乙酰转移酶（ChAT）启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的转基因小鼠。

解剖在衬有 Sylgard 硅胶的铝制培养皿中进行，该培养皿放置在冰上冷却。在本研究中，6 周龄以上（P42 及以上）的动物被视为成年动物。成年雄性或雌性小鼠腹腔注射氯胺酮（150 毫克 / 千克体重）和甲苯噻嗪（20 毫克 / 千克体重）的混合物。在小鼠失去翻正反射后，将其仰卧放置在冰床上，直至失去趾捏反应（约 10 - 15 分钟）。诱导的轻微低温可能有助于对随后的损伤提供一定程度的保护。科学家们之前曾尝试在断头前用冷却的 DaCSF 对动物进行心内灌注，但未观察到所获得切片质量的实质性改善。因此，为了简化实验方案，决定不再使用该方法。

然后将动物断头，立即将躯干浸入冷却的 DaCSF 中，并排出血液。然后将躯干通过四肢固定在冷却的衬有 Sylgard 硅胶的金属培养皿底部，该培养皿充满冷却的 DaCSF 并放置在冰床上。去除皮肤，并将动物内脏取出以暴露脊柱。将培养皿中的 DaCSF 更换为干净的溶液，然后进行椎板切除术以暴露脊髓。用镊子夹住脊髓的颈椎端并提起，用一把精细的显微剪刀剪断背根和腹根（离脊髓相对较远），以便将脊髓从脊柱中取出。用镊子夹住脊髓的尾端，从尾端向颈椎端拉动神经根，将其剥离。这个过程不仅可以去除脊髓的神经根，还可以去除覆盖在上面的脑膜。虽然乍一看这种机械剥离方式可能会对运动神经元造成损伤，而且不可否认可能确实如此，但科学家们坚持这样做，只是因为它能够干净、完整地去除脑膜。总的来说，发现硬脑膜去除不充分会导致脊髓切面质量较差，这对运动神经元的健康甚至会产生更有害的后果。随后分离脊髓的腰膨大部分，然后将其转移到含有预热至 35 摄氏度的干净 DaCSF 的烧杯中。将烧杯保持在室温（RT），并向其中的溶液中通入混合气体 15 分钟。这样做的基本原理是让脊髓有一些时间从解剖创伤中恢复，并在嵌入琼脂糖之前使其适应相对较高的温度。

使用低熔点琼脂糖，这是一种凝胶点为 1.5%、凝固点在 24 - 28 摄氏度的低熔点琼脂糖，用于嵌入脊髓。使用凝固温度足够低的琼脂糖很重要，以避免脊髓暴露在较高温度下以及温度冲击，因为这可能对组织产生有害后果。通过实验，科学家们发现使用 4%（重量 / 体积）的该琼脂糖在 DaCSF 中的溶液所获得的凝胶强度足以顺利切割成年脊髓。如果使用明显较低的凝胶强度，会导致切片质量较差，因为刀片会压缩脊髓，在极端情况下会导致脊髓从琼脂块中脱出，这通常会对组织造成灾难性的后果。将琼脂糖在微波炉中加热溶解在 DaCSF 中，然后倒入放置在冰上的培养皿中。当培养皿中心（即将嵌入脊髓的位置）的温度降至约 29 - 30 摄氏度时，将脊髓的一端接触用 DaCSF 湿润的纸巾，沥干液体，然后将其插入仍处于熔融状态的琼脂糖中，并使其伸直。对分离的腰段脊髓的所有操作都是通过夹住其腰上段来进行的，因为通常从腰段中部到下部获取切片。将含有脊髓的琼脂糖在冰上使其凝固，大约 5 分钟后，当完全凝固后，将冷的 DaCSF 倒在培养皿顶部。虽然在这种环境下等待 5 分钟可能看起来违反直觉，但科学家们发现这段时间对于获得最佳切片所需的凝胶强度很重要。切出含有嵌入脊髓的琼脂块，并进行修整，在侧边边缘留下大约几毫米的琼脂糖，在与切片机刀片接触的前边缘留下更少的琼脂糖。在后部保留大约一厘米的长度，以便刀片在横向切过脊髓后能够继续前进。将 5% 的琼脂块粘在振动切片机的切割台上作为支撑，将含有嵌入脊髓块的琼脂糖块粘在前面（骶端朝上）。使用胶水，并立即将切割台浸入冷却的 DaCSF 中，以消散胶水固化时可能产生的热量。此时脊髓已准备好使用振动组织切片机进行切片。

科学家们的经验表明，顺利切割组织至关重要，因为这有助于维持靠近但低于切片表面（50 - 70 微米）的浅层组织的相对完整性，而视觉引导的膜片钳记录通常就是从这个区域获取的。刀片应通过组织进行相对大幅度和高频率的水平振荡，同时推进速度要慢，并且在垂直 z 轴方向上的振动要相对可以忽略不计。科学家们认为，对于像成年脊髓这样敏感的组织，使用 z 轴振动最小的组织切片机可以显著提高细胞活力。使用振动组织切片机（Vibratome 3000 型）对脊髓进行横向切片。将一半的双刃碳钢刀片与水平面成 20 度角放置，振动幅度设置为 9.5（最大设置为 10，对应幅度为 1.5 毫米），振动频率为 60 赫兹，z 轴峰峰值振动最小化至 3 微米，推进速度约为 100 微米 / 秒。[这是仪器允许的最慢速度，不过科学家们推测进一步降低速度（约 50 微米 / 秒）可能会有益处。] 切片室周围用冰包围，从脊髓的侧边缘开始切割组织。通常，最初的几片切片会被丢弃。科学家们最初将切片切为 450 微米厚，以最大限度地保持树突分支的完整性，但注意到降低厚度（325 - 350 微米）可获得更好的效果，推测这是因为切片核心能更好地进行氧合作用和营养物质传递。这也改善了切片中神经元的可视化效果。

切割后，通过向切片边缘吹气使每片切片从琼脂糖外壳中脱离，然后用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管将其转移到 30%（重量 / 体积）的聚乙二醇（PEG，Mn = 1,900 - 2,200）的蒸馏水溶液中 60 秒，每片切片使用新鲜的 PEG 溶液。PEG 处理方案的细节如之前所述。然后将每片切片用新鲜的 35 摄氏度 DaCSF 溶液洗涤两次，每次一分钟，然后转移到含有 35 摄氏度 DaCSF 的孵育室中。切出空的琼脂糖外壳，并获取更多的切片（每次制备约 5 - 6 片切片）。切片完成后，所有切片在 35 摄氏度的 DaCSF 中再孵育 30 分钟，然后在 35 摄氏度的 RaCSF 中再孵育半小时。用于孵育的孵育室类似于之前的孵育室，孵育室内的切片悬浮在网孔上并完全浸没在溶液中。注意避免切片聚集在一起，并且使用的溶液量保持在使切片完全浸没所需的最小量。溶液持续用混合气体鼓泡，注意避免对切片造成不必要的机械振动和损伤。随后，将切片转移到室温的 RaCSF 中，并在静态界面条件下保存。在将切片用于记录之前，大约等待 30 分钟。与将切片完全浸没相比，在界面条件下保存切片明显提高了它们的活力。这与之前的观察结果一致，即与将切片浸没相比，保存在气液界面的切片显示出更好的电生理和形态学特征。通过将液体水平降低到仅覆盖切片上层的一层薄膜，而其下表面与剧烈通入混合气体的孵育液接触，大致模拟了界面条件。用盖子覆盖装置使其保持封闭，从而创造一个潮湿的环境，并插入一根管子在切片上方吹入额外的混合气体。虽然切片后的孵育方案确保切片在 35 摄氏度下加热 1 - 1.5 小时，但随后将它们保持在室温，因为切片在较高温度下会更快地变质。所有记录均在室温下进行。通过这种方式，切片在制备后的至少 5 - 6 小时内保持健康状态，可用于实验。上述制备方案， 从最初给动物注射麻醉剂到准备好第一片切片用于记录 ，在 3 小时内完成。

️03. 全细胞膜片钳记录

一旦优化了技术，使得切片中存在荧光标记的运动神经元，科学家们就继续通过膜片钳记录来研究它们的活力。本文中报道的电生理记录来自 9 只动物，尽管在实验程序的开发和优化过程中使用了更多的动物。将单个切片转移到聚碳酸酯记录室中，并用带有莱卡纤维的不锈钢竖琴固定。切片在室温下用通入混合气体的 RaCSF 以约 3 毫升 / 分钟的速度连续灌流。在固定台直立显微镜上，使用视频增强型红外微分干涉对比（IR-DIC）光学系统和水浸透镜对切片进行可视化，该显微镜也配备了荧光成像功能。通过对近红外范围敏感的 CCD 相机（DAGE-MTI IR-1000 型；DAGE-MTI 公司）以及图像采集卡（DAGE-MTI Investigater 型）在黑白电视监视器上观察图像，并在个人计算机上捕获。

️ 三、结果

开发该实验程序的目标是制备出一种标本，能够可靠地对已鉴定的成年运动神经元进行视觉引导下的膜片钳记录。视觉引导可确保对大型腹角神经元进行靶向，并能特异性地靶向经基因鉴定的神经元（例如，在特定的运动神经元亚群中表达荧光蛋白的神经元）。制备方法的开发过程涉及对实验程序和溶液成分进行基于经验的优化。在对实验程序进行迭代优化的过程中，科学家们通过视觉标准来评估每一项改进，也就是所获得的荧光标记运动神经元的数量，以及这些细胞看起来是否健康（例如，它们是否肿胀或外观上有斑点）。图 1 中的 A 和 B，分别是使用 ×10 物镜从年龄为 P43 和 P48 的动物所制备的切片的一个腹角获取的代表性低倍荧光图像。令人惊讶的是，当采用侧向方法切割组织时，科学家们通常仅在切片的一个腹角内观察到明显的标记。若沿背腹或腹背方向切割，得到的标记数量甚至更低。对于这一现象，科学家们没有确切的解释，但它可能与组织和刀片表面的摩擦所产生的有害影响有关。图 1 中的 C 和 D，分别是从一只 P45 动物制备的代表性切片的更高倍数（×40）的荧光图像和红外微分干涉对比（IR-DIC）图像。在荧光图像（图 1C）中，细胞的边缘非常清晰，而在 IR-DIC 图像（图 1D）中，相对而言更难以辨别这些边缘，推测这是因为这些细胞位于相对较厚的切片表面下方。然而，靠近表面的细胞，尽管更容易可视化和定位，但往往无法提供令人满意的记录结果。因此，为了进行记录，有必要将位于表面下方较深处的细胞作为目标，因为根据诸如稳定的静息膜电位（RMP）以及记录能够持续的时长等标准来判断，这些细胞更有可能提供更高质量的记录。图 1 中 C 和 D 所示的单个细胞，其所处深度可能已接近科学家们能够进行记录的极限。对更深层的细胞进行定位，至少在 IR-DIC 照明下，就如同盲目进行膜片钳操作一样。另一方面，荧光在这些深度处的衰减并不那么急剧，并且如有必要，在膜片钳操作过程中可以将其用作引导线索。然而，即便采用这种方法，对非常深层的细胞进行膜片钳操作仍然是一个挑战。鉴于在确定哪些标记细胞可用于记录方面存在这些实际限制，由此可知，获得含有大量标记细胞的切片能够提高成功的概率。这是在使用年龄较大的动物时面临的首要挑战。科学家们通常用于记录的动物年龄在 6 至 8 周的范围内，不过，他们成功进行记录的最年长的动物年龄为 P68。

图 1.成人腰椎脊髓横切片内增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 标记的运动神经元的视频显微照片。A 和 B：P43 (A) 和 P48 (B) 年龄动物在较低放大倍数下获得的切片荧光图像。图像显示切片单个角内存在标记的腹角运动神经元。A 和 B 的比例尺为 50 μm。C 和 D：P45 标记运动神经元在较高放大倍数下的荧光 (C) 和红外微分干涉对比 (IR-DIC；D) 图像。C 和 D 的比例尺为 20 μm。为了便于识别，IR-DIC 图像 (D) 中的细胞已被限制在边缘破损的框中。

️01.成年腰部运动神经元的全细胞膜片钳记录及内在特性评估

为了验证所采用的制备方法，我们对表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）:: 增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的小鼠中 eGFP 阳性的运动神经元进行了全细胞膜片钳记录。我们之前已经确定，在这些小鼠的腹角中，eGFP 阳性的神经元就是运动神经元，而且几乎没有其他胆碱能神经元会表达 eGFP 。所有标记细胞都位于侧面，且处于穿过中央管的假定水平轴的腹侧，这表明这些细胞是躯体运动神经元，而非自主运动神经元。图 1 的 C 和 D 中所示的运动神经元，其胞体长轴直径为 30 微米。从代表我们所记录细胞的 24 张运动神经元胞体图像的数据集中，我们得出胞体长轴的平均直径为 35±8 微米。最近的一项研究报告称，21 日龄小鼠中 γ 运动神经元的平均直径为 17 微米，而 α 运动神经元的平均直径为 31 微米 。在记录过程中，我们试图以胞体较大的神经元为目标。再结合这些细胞的位置，以及它们是 ChAT（eGFP）阳性这一事实，使得这些细胞很有可能是躯体腰部的 α 运动神经元 。然而，在已记录的细胞中，我们仅测量了其中两个细胞的胞体长轴直径（表 1 中的细胞 3 和细胞 6，其直径分别为 45 微米和 30 微米），所以我们不能确定所有记录的神经元都是 α 运动神经元，其中一些可能是 γ 运动神经元。通过荧光鉴定细胞后，在正压下将膜片钳电极靠近细胞，并形成千兆欧姆封接，之后进入全细胞模式。在长达 1 至 2 小时的记录过程中，由于 eGFP 蛋白的透析作用，被封接神经元的荧光通常会减弱，而且常常会消失，这种现象与我们之前报道的另一种细胞质蛋白 —— 胆碱乙酰转移酶（ChAT）的情况类似 。

图 2 和图 3 显示了从单个标记的成人 MN (P47) 获得的记录示例轨迹，该 MN 对应于表 1-3 中的细胞 2。它们表明可以从这些细胞中成功获得稳定的、视觉引导的全细胞记录。所描述的准备程序通常会产生可行且看起来健康的切片。当视觉识别和定位适当的健康细胞时，我们在获得全细胞记录和能够将细胞保持近 2 小时的成功率接近 100%。在建立全细胞配置后，允许细胞透析约 10 分钟，以确保细胞内成分的合理完全交换。这是基于脊髓 MN 中的交换时间常数约为 3.4 分钟的事实（Palecek 等人，1999 年）。通常 RMP 会在该时间段内稳定下来。如果 RMP 仍然显示出向超极化方向移动的迹象，我们会再等待几分钟再记录数据。利用这种全细胞记录，我们已经描述了这些成年腰椎 MN 的内在被动和动作电位发放特性，以及个体动作电位的特性。

图 2.去极化诱导的成年运动神经元动作电位放电。显示的示例细胞是从 P47 龄小鼠中记录的。A–D：电压记录显示，在较小的刺激电流（20 pA；D）下发生被动去极化，在较高的刺激电流（分别为 C、B 和 A 的 40、100 和 650 pA）下动作电位放电频率增加。请注意，在 A 的初始部分观察到了一些尖峰频率适应。A–D 的比例相同。E：A–D 中所示细胞的动作电位频率与刺激电流强度的关系图（I-F 图）。实线是数据的线性拟合。F：通过来自同一细胞的短暂电击刺激（10 毫秒）引发的动作电位。所采用的刺激强度是刚好引发动作电位所需的大小（在此示例细胞中为 200 pA）。此处显示的轨迹是 10 个此类连续获得的记录的平均值。如图所示，显示的尖峰波形被截断。轨迹显示尖峰（箭头所示）之后的快速后超极化 (fAHP)，随后是中等后超极化 (mAHP；实心三角形所示) 的显著慢波形，该波形紧随单个动作电位之后。

图 3.成年腰椎运动神经元在静息状态下的超极化。显示的示例细胞是从 P47 龄小鼠中记录的。A：电压记录显示被动超极化，初始刺激电流较小，随后出现去极化电压下降，超极化较大。轨迹中显示的是 800 毫秒的记录，连续超极化电流增量为 40 pA。空心圆和实心圆表示测量峰值和稳态电压的相应时间点。B：A 中所示细胞数据的电压-电流 (V-I) 图。每条轨迹的峰值和稳态电压都已绘制成与相应刺激电流的关系图。符号含义与 A 中相同。

我们发现，一旦优化了制备方法并开始进行电生理实验，就从连续的九次制备中（100%）获得了记录数据。也就是说，我们展示的数据来自按照该方案制备的切片中，成功记录的九只 42 日龄以上（P42）的成年运动神经元。那些在没有注入任何偏置电流的情况下就持续发放动作电位，因而缺乏稳定静息膜电位（RMP）的细胞被排除在外。该数据集中的细胞平均年龄约为 P51（表 1），平均静息膜电位为 - 73±2 毫伏。

在静息膜电位稳定后，通过在 9 秒的时间间隔内，对持续 1.5 秒的电流阶跃进行约 15 次扫描并取平均值来测量输入电阻（IR），该电流阶跃使细胞超极化至静息膜电位以下约 3–5 毫伏。这些细胞的平均输入电阻为 123±54 兆欧。

然后，大约每隔 10 秒，以持续 1 秒的递增正向电流注入，依次使细胞去极化。随着正向电流注入的增加，细胞最初表现出被动的欧姆响应（图 2D），随后它们会发放大幅的超射动作电位。基强度被定义为能够从静息膜电位引发 1 个或 2 个动作电位的去极化电流的最小幅度，通过持续 1.5 秒的电流阶跃来引发。需要注意的是，在引发动作电位发放之前，我们没有通过注入偏置电流将每个细胞的静息膜电位调整到一个共同的值。平均基强度值为 113±154 皮安。基强度与相应输入电阻值的乘积表明，平均而言，这些细胞需要在静息膜电位基础上再去极化 8±6 毫伏才能开始发放动作电位。随着进一步的去极化，发放频率会随着刺激强度的增加而增加（图 2，A–C）。发放频率通过计算 1 秒长的电流阶跃内的动作电位数量来估算。发放频率与刺激电流的关系图（I-f 图）如图 2E 所示。平均发放增益（I-f 斜率）为 0.09±0.03 赫兹 / 皮安。将发放增益除以输入电阻进行归一化处理，得到以赫兹每毫伏为单位的归一化增益 。从九个细胞中，我们得到的归一化发放增益为 0.8±0.3 赫兹 / 毫伏，这表明超过阈值电压后，成年运动神经元的发放频率将以每增加相当于产生 5 毫伏被动去极化的电流，约增加 4 赫兹的速率上升。I-f 关系呈线性（图 2E），没有任何初级以下或次级发放范围的迹象。

然后，以大约 10 秒的时间间隔注入持续 1 秒的递增超极化电流阶跃（图 3A）。图 3 显示，在静息膜电位以下的小幅度超极化会引发相对被动的响应，而较大幅度的超极化会引发随时间变化的去极化电压下陷。这一特征表明存在与时间相关的异常整流现象，对应于由于 h 电导激活导致的斜率电阻降低 。这在图 3B 中得到了说明，图 3B 是该数据的电压 - 电流（V-I）图。对应于每个超极化的峰值电压和稳态电压的电压值已针对相应电流阶跃的幅度进行了绘图。随着较大幅度的超极化，这两个值开始出现偏差，稳态值最终达到较低的斜率电阻，表明存在异常整流现象。对每个细胞的整个峰值电压图和稳态电压图的后段线性部分进行线性拟合，以获得各自的斜率电阻。通过确定异常整流比（ARR）来量化异常整流的程度，异常整流比的计算方法是将峰值斜率电阻除以稳态斜率电阻 。我们得到的平均异常整流比值为 1.8±0.2。上述参数的详细信息见表 1。

我们从平均年龄约为 P52 的七个细胞的数据集中，对单个动作电位的参数进行了定量表征（表 2）。为了以客观的方式进行表征，仅测量在基强度下引发的第一个动作电位的特征。对于每个细胞，所报告的值是从五个单独的动作电位中获得的平均值。除动作电位幅度外的各个参数，在很大程度上与科学家及其同事对丘脑底核神经元的研究中所定义的一致 。动作电位超射的峰值正电压表示为 Vo，动作电位下射的峰值负电压表示为 Vu。动作电位电压阈值（Vthr）被确定为上升支之前的电压轨迹中的拐点 —— 在这一点上动作电位开始产生，膜进入强再生状态。通过观察原始电压轨迹或其一阶时间导数来凭肉眼确定拐点。我们得到的平均 Vthr 值为 - 57±5 毫伏。动作电位幅度定义为（Vo - Vthr），平均值为 73±5 毫伏，动作电位宽度测量为动作电位幅度一半处的时间宽度，平均值为 0.7±0.1 毫秒。动作电位上升支期间的最大上升速率平均为 219±33 毫伏 / 毫秒。该值与动作电位上升支期间流过膜的最大净内向电流（大概以钠离子电流为主）成比例，因此可以指示该电流。相应地，动作电位下降支期间的最大下降速率为 - 121±27 毫伏 / 毫秒。动作电位达到峰值的时间定义为动作电位起始点（Vthr）与动作电位达到峰值点（Vo）之间的时间差。我们得到该参数的平均值为 0.7±0.1 毫秒。动作电位下降时间定义为动作电位电压从峰值下降到与 Vthr 相等的值所需的时间。动作电位的平均下降时间值为 0.9±0.2 毫秒。

接下来，我们对超极化后电位（AHP）进行了量化。脊髓运动神经元的超极化后电位有两个成分 ，一个是持续约 2–10 毫秒的快速成分（fAHP），另一个是持续数十毫秒的中等成分（mAHP）（图 2F）。快速超极化后电位（fAHP）是从基强度下引发的第一个动作电位来进行量化的，测量方式为动作电位下降支之后紧接着的峰值超极化电压偏移值（Vu）与动作电位起始的电压阈值（Vthr）之间的差值。成年运动神经元表现出的平均快速超极化后电位（fAHP）幅度为 15±5 毫伏。对蜂毒明肽敏感的中等超极化后电位（mAHP）至关重要，因为它的持续时间决定了哺乳动物运动神经元的发放速率 。为了研究中等超极化后电位（mAHP），使用频率为 0.1 赫兹、持续时间为 10 毫秒的短暂电刺激来引发动作电位。逐渐增加刺激强度，直到刚好能够触发一个动作电位。对十个这样引发的电压波形取平均值，以表征中等超极化后电位（mAHP）。图 2F 显示了一个动作电位（在图中进行了截断），随后是一个中等超极化后电位（mAHP），它逐渐衰减至静息膜电位（RMP）。我们从平均年龄约为 P50 的五个细胞的数据集中（表 3），对中等超极化后电位（mAHP）的参数进行了定量表征 。中等超极化后电位（mAHP）的幅度定义为中等超极化后电位（mAHP）的负峰值与静息膜电位（RMP）之间的电压差。成年腰部运动神经元的平均中等超极化后电位（mAHP）幅度为 4±2 毫伏。中等超极化后电位（mAHP）的持续时间被视为达到动作电位的峰值负电压下射点（Vu）与中等超极化后电位（mAHP）波形达到基线静息电压（RMP）点之间的时间差。我们得到的平均中等超极化后电位（mAHP）持续时间为 237±42 毫秒。中等超极化后电位（mAHP）达到峰值的时间定义为两个时间点的差值，即 Vu 和中等超极化后电位（mAHP）达到的峰值负电压。我们得到该参数的平均值为 36±19 毫秒。中等超极化后电位（mAHP）的半衰减时间被量化为中等超极化后电位（mAHP）波形从其峰值电压衰减到对应于中等超极化后电位（mAHP）幅度一半的值所需的时间，平均值为 57±10 毫秒。

️02.成年腰部运动神经元的全细胞膜片钳记录及内在特性评估

为了验证所采用的制备方法，我们对表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）:: 增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的小鼠中 eGFP 阳性的运动神经元进行了全细胞膜片钳记录。我们之前已经确定，在这些小鼠的腹角中，eGFP 阳性的神经元就是运动神经元，而且几乎没有其他胆碱能神经元会表达 eGFP。所有标记细胞都位于侧面，且处于穿过中央管的假定水平轴的腹侧，这表明这些细胞是躯体运动神经元，而非自主运动神经元。图 1 的 C 和 D 中所示的运动神经元，其胞体长轴直径为 30 微米。从代表我们所记录细胞的 24 张运动神经元胞体图像的数据集中，我们得出胞体长轴的平均直径为 35±8 微米。最近的一项研究报告称，21 日龄小鼠中 γ 运动神经元的平均直径为 17 微米，而 α 运动神经元的平均直径为 31 微米。在记录过程中，我们试图以胞体较大的神经元为目标。再结合这些细胞的位置，以及它们是 ChAT（eGFP）阳性这一事实，使得这些细胞很有可能是躯体腰部的 α 运动神经元。然而，在已记录的细胞中，我们仅测量了其中两个细胞的胞体长轴直径（表 1 中的细胞 3 和细胞 6，其直径分别为 45 微米和 30 微米），所以我们不能确定所有记录的神经元都是 α 运动神经元，其中一些可能是 γ 运动神经元。通过荧光鉴定细胞后，在正压下将膜片钳电极靠近细胞，并形成千兆欧姆封接，之后进入全细胞模式。在长达 1 至 2 小时的记录过程中，由于 eGFP 蛋白的透析作用，被封接神经元的荧光通常会减弱，而且常常会消失，这种现象与我们之前报道的另一种细胞质蛋白 —— 胆碱乙酰转移酶（ChAT）的情况类似。

️四、讨论

在本文中，我们描述了一种成年小鼠的体外脊髓切片制备方法，通过该方法可以从腰部运动神经元获得全细胞膜片钳记录。除了制备过程外，我们还展示了成年小鼠运动神经元的电生理记录，并对这些细胞的内在动作电位特性进行了量化。展示这些记录的主要目的是验证该方法，而不是为了与先前发表的研究进行对比性的特征描述。

️01. 限制能量衰竭

开发这项技术的关键挑战是减轻在制备过程中由于血液循环中断而导致的能量衰竭。葡萄糖是哺乳动物大脑的主要能量来源，可通过氧化或非氧化（糖酵解）方式进行代谢。缺氧会导致氧化磷酸化的终止，而氧化磷酸化产生的三磷酸腺苷（ATP）最多。此时，能量需求只能完全由糖酵解来满足，而在正常情况下，糖酵解过程仅能提供神经元所需能量的 5%。在静息状态下，大脑中产生的近 50–60% 的 ATP 用于维持和支持质膜两侧的离子不平衡，没有这种离子不平衡，就不会发生电信号传导。ATP 水平的下降会导致 ATP 依赖的钠钾泵失效，从而使钠离子在细胞内积累。钠离子反过来会通过被动的氯离子泄漏拉动氯离子进入细胞，这会导致细胞内氯化钠的积累，渗透压驱动的水分进入细胞增加，进而导致细胞肿胀。这个过程被称为细胞毒性水肿，最终会导致细胞以一种称为细胞肿胀性坏死的过程死亡。在低温条件下进行大部分制备过程，是一种降低代谢速率的尝试，从而更好地维持组织中的 ATP / 能量水平，以限制细胞肿胀性坏死。

此外，我们确保了有适当的葡萄糖供应。脑脊液中的正常葡萄糖水平在 0.5 到 5 毫摩尔每升之间。然而，对脑切片制备方案的调查表明，通常会使用高血糖浓度（范围在 10–25 毫摩尔每升）。这被认为是必不可少的，因为在没有血液供应的情况下，营养物质必须从细胞外液扩散到组织的深层。对于成年运动神经元，我们通过实验确定最佳的葡萄糖水平在 15–20 毫摩尔每升范围内。

我们还添加了丙酮酸钠乙酯，它是一元羧酸丙酮酸的脂肪族酯。丙酮酸是糖酵解的内源性代谢产物，它要么进入线粒体，在三羧酸（TCA）循环中进行后续氧化，要么在细胞质中被无氧转化为乳酸。因此，当外源添加丙酮酸时，它应该绕过糖酵解，并通过三羧酸循环促进 ATP 的生成，从而提高细胞的能量状态。在缺氧条件下，丙酮酸会被细胞质中的乳酸脱氢酶转化为乳酸（随后进入细胞外空间并被冲走）。这会再生还原型辅酶 Ⅰ（NAD+），并增加细胞质中 NAD + 与还原型辅酶 Ⅰ（NADH）的比例，这反过来对于防止糖酵解停滞至关重要。因此，在无氧条件下，丙酮酸通过维持无氧糖酵解来帮助生成 ATP。

考虑到这些因素，许多先前发表的脑切片制备方案都在其溶液中添加了作为钠盐的丙酮酸。然而，丙酮酸钠不稳定，在水溶液中会迅速二聚化（约 20 分钟），形成无代谢活性的丙酮酸水合物，随后更缓慢地转化为对三羧酸循环起抑制作用的仲丙酮酸 —— 这种化合物会对体外已经受损的细胞能量代谢产生不利影响。因此，在溶液中添加丙酮酸的无机盐，至少会阻碍充分实现外源添加丙酮酸作为能量来源或减轻氧化应激（如下所述）的潜在益处。

这些问题可以通过使用丙酮酸的乙酯，即丙酮酸钠乙酯来克服，它是丙酮酸的前药，并且相对更具亲脂性。因此，它可以穿透细胞，随后在细胞内被酯酶水解，释放出丙酮酸。这与使用无机丙酮酸盐不同，使用无机丙酮酸盐时，丙酮酸的摄取将由质子偶联的单羧酸转运体介导，而在普遍存在的氧化应激条件下，这些转运体的完整性可能会受到损害。此外，去酯化作用建立了一个跨细胞梯度，这反过来有利于乙酯的进一步进入，从而使高水平的丙酮酸在细胞内积累。丙酮酸钠乙酯甚至可以穿过细胞内膜，并在线粒体中大量积累，而线粒体是氧化代谢的主要场所，因此增强了其神经保护作用。除了作为代谢底物发挥作用外，丙酮酸还作为内源性的促氧化剂清除剂，因此在其作用中具有神经保护作用。因此，与外源添加的无机丙酮酸盐相比，使用丙酮酸钠乙酯可以提供更有效的抗氧化保护和代谢促进作用。已经证明它在缺血后大脑和脊髓损伤的小鼠模型中具有神经保护作用。我们在人工脑脊液（aCSF）溶液中添加了浓度为 5 毫摩尔每升的丙酮酸钠乙酯。添加更高浓度（10 毫摩尔每升）并没有被证明是有益的，并且从切片内细胞的外观判断，甚至可能有一些有害影响，也许是通过其转化为乳酸和由此产生的酸中毒，或者是通过细胞内释放的乙醇的影响。我们还尝试使用苹果酸，它是另一种三羧酸循环中间产物，以便通过增强线粒体功能的保护来进一步提高溶液的神经保护潜力。然而，除了丙酮酸钠乙酯外，添加了苹果酸二乙酯（1 毫摩尔每升）的溶液并没有显示出任何明显的改善。

️02. 细胞外溶液中离子的替代和渗透剂的使用

鉴于细胞内钠离子积累的影响，最早用于制备可用于记录运动神经元的存活切片的方法之一，是用一种不可渗透的分子（如蔗糖）替代人工脑脊液（aCSF）中的钠离子（氯化钠）。多年来，研究人员尝试了其他替代钠离子的物质，而不是蔗糖，并且效果各异。根据一篇已发表的报告，我们最初尝试用甘油替代钠离子，但几乎没有得到什么好处，因此在解剖用人工脑脊液（DaCSF）中又恢复使用蔗糖作为钠离子的替代物。此外，我们发现在解剖用人工脑脊液（DaCSF）中，通过使用碳酸氢胆碱缓冲液替代碳酸氢钠缓冲液中的 26 毫摩尔每升的钠离子，提高了细胞活力。而且，替代氯化钠会导致氯离子的去除，没有氯离子就不会发生细胞肿胀性坏死。我们通过使用其他盐类，如用葡萄糖酸钾替代氯化钾，用硫酸镁替代氯化镁，进一步降低了解剖用人工脑脊液（DaCSF）中的氯离子浓度。因此，解剖用人工脑脊液（DaCSF）中残留的钠离子和氯离子浓度极低（来自添加的 1 毫摩尔每升的抗坏血酸钠、2 毫摩尔每升的犬尿烯酸钠和 1 毫摩尔每升的氯化钙）。

缺氧诱导的钠钾 ATP 酶泵失效以及细胞内钾离子的耗散性流失，会导致缺氧去极化，这反过来可能导致电压依赖性通道（包括钙离子通道）的开放，从而促进钙离子在细胞内的积累。细胞内钠离子的积累，加上去极化，也会促进钠钙交换体的反向运作。这与钙 ATP 酶的失效相结合，会导致细胞内钙离子过载，以及细胞内高浓度钙离子相关的细胞毒性作用。因此，阻断钙离子内流途径似乎对神经元有有益的影响。直观上看，在解剖用人工脑脊液（DaCSF）中去除所有细胞外钙离子，并提高镁离子水平以阻断电压门控钙离子通道，应该会增强神经保护程度。然而，我们发现这样做会使切片不健康。在尝试记录时，我们观察到这些切片的表面很僵硬，很难穿透。这可能导致玻璃被组织碎片更多地污染，从而在获得千兆欧姆封接时成功率低得多。即使获得了封接并成功进入细胞，我们也观察到很难将这些记录维持几分钟以上。对于这种细胞质量差的一种推测性解释可能是，神经元大概需要一个 “钙离子设定点”—— 细胞内钙离子浓度的最佳范围 —— 才能存活。浓度过高会导致细胞因坏死而死亡，而浓度过低也会通过促进细胞凋亡而致命。此外，神经元也有可能通过 “钙悖论” 效应受到损伤，即在暴露于无钙环境后恢复正常的钙离子水平，会导致细胞内钙离子浓度出现反常的显著增加。通过进一步的实验，我们凭经验确定，解剖用人工脑脊液（DaCSF）中镁离子与钙离子的比例为 4:1 时，既能保证细胞存活，又能避免上述问题。

我们人工脑脊液（aCSF）溶液中的另一种添加剂是多元醇肌醇（3 毫摩尔每升）。肌醇除了参与细胞内信号传导化合物（如三磷酸肌醇，IP3）的生成外，还是细胞中的一种主要有机渗透剂。有机渗透剂是在细胞内积累并分泌的分子，用于适应性地对抗水分的流入和随后细胞体积的变化。它们相对惰性的性质使细胞能够耐受其细胞内浓度的显著变化，而对细胞结构或功能没有任何重大影响。如上所述，切片中的细胞有肿胀的趋势，并且这种趋势会持续到制备后的时期。在制备阶段，细胞中肌醇的消耗会削弱细胞对抗渗透压介导的水分流入的能力，也会影响维持足够水平的肌醇磷酸信号分子。因此，我们在人工脑脊液（aCSF）溶液中添加了肌醇，目的是让神经元摄取这种分子，从而补充其损失。我们确实观察到了明显的好处，即现在更容易进入全细胞模式。除了一般推测这可能反映了由于细胞活力增强而导致的更高的膜完整性外，我们不知道确切的解释。

️03. 限制兴奋性毒性和抗氧化剂的使用

细胞外谷氨酸的增加可通过兴奋性毒性过程导致神经元死亡。突触前钠离子的积累，加上去极化，会导致钠离子依赖的谷氨酸转运体的反向运作，这可能导致谷氨酸的释放，从而在突触间隙中积累谷氨酸。这会激活 α- 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸（AMPA）/ 红藻氨酸盐和 N - 甲基 - D - 天冬氨酸（NMDA）受体，导致钠离子和钙离子的流入。运动神经元对这种兴奋性毒性特别敏感，因为它们含有可透过钙离子的 AMPA 受体。此外，脊髓运动神经元中钙离子结合蛋白的缺乏，导致细胞质中钙离子的缓冲能力较低，因此对细胞内钙离子浓度的任何增加都非常敏感。此外，细胞质中钙离子水平的升高及其随后被线粒体摄取，会导致氧化磷酸化的抑制，并增加包括过氧化氢、超氧阴离子和过氧亚硝酸盐在内的活性氧（ROS）的产生，从而促进氧化应激。这些活性氧可以迅速与 DNA 发生反应，或导致脂质过氧化和膜损伤，此外还会不可逆地损害关键蛋白质，通常会对细胞造成严重后果。与其他细胞类型（如背角神经元）相比，脊髓运动神经元对线粒体功能障碍的后果要敏感得多。因此，我们使用了一些技术来限制兴奋性毒性和氧化应激的影响。

因此，使用谷氨酸拮抗剂应该能提供更高程度的神经保护。我们已经证实，在解剖用人工脑脊液（DaCSF）中添加浓度为 2 毫摩尔每升的谷氨酸拮抗剂犬尿烯酸，可阻断 NMDA 和非 NMDA 受体，这对细胞活力有有益的影响。这个浓度大概也会阻断 α7 烟碱型乙酰胆碱受体，考虑到我们的解剖用人工脑脊液（DaCSF）中存在烟碱激动剂胆碱，这可能很重要。此外，在麻醉混合剂中使用氯胺酮可能也有助于阻断谷氨酸受体，因为已知它能拮抗 NMDA 受体。

我们试图通过在解剖用人工脑脊液（DaCSF）和记录用人工脑脊液（RaCSF）溶液中添加抗氧化剂抗坏血酸钠（维生素 C）来降低氧化应激水平，以清除细胞毒性自由基。（抗坏血酸盐可能还通过谷氨酸 / 抗坏血酸盐交换促进谷氨酸的摄取，从而发挥额外的神经保护作用。）抗坏血酸盐和还原型谷胱甘肽（GSH）是大脑中两种主要的水溶性抗氧化剂，在切片制备过程中的缺氧去极化后会减少。抗坏血酸盐在神经元细胞内的平均浓度约为 10 毫摩尔每升，并且 l - 立体异构体可以被神经元从细胞外液中摄取。另一方面，还原型谷胱甘肽不会被细胞从浴液中摄取，因此以其在神经元内的内源性浓度 2.5 毫摩尔每升被包含在细胞内电极液中。对各种切片制备方案的调查显示，抗坏血酸盐的补充浓度通常在 0.4–1 毫摩尔每升之间，其中 0.4 毫摩尔每升是细胞外液中的内源性浓度。我们使用了该范围的较高值（1 毫摩尔每升）。一个有趣的现象是，海龟的大脑抗坏血酸盐水平极高，这可能是其体外脊髓制备方法稳健性的原因。抗坏血酸盐及其氧化类似物脱氢抗坏血酸盐（随后在细胞内还原为抗坏血酸盐）都是通过转运体介导的机制被细胞摄取的。为了绕过这一步骤，并期望达到更高的细胞内抗氧化剂浓度，我们尝试在溶液中用 TEMPOL（0.75 毫摩尔每升）替代抗坏血酸盐，TEMPOL 是一种合成的膜渗透性超氧化物歧化酶模拟物。然而，我们没有观察到任何额外的改善，因此在溶液中保留了内源性的抗坏血酸盐。

️04. 使用聚乙二醇和随后在较高温度下孵育

切片切割后，立即将其暴露于聚乙二醇（PEG）的水溶液中。科学家首次证明，PEG 能增强体外制备的神经元存活。我们已经证实，PEG 处理能增强神经元活力，并将其步骤纳入了我们的方案。推测 PEG 作为膜融合剂起作用，通过促进膜破损的快速重新密封来减少机械损伤，从而提高神经元存活率。先前的研究表明，PEG 通过从膜表面的亲水基团去除水分，导致紧密相邻的细胞膜融合。此外，观察到 PEG 处理能降低氧化应激水平。这可能是膜重新融合从而减少钙离子进入的结果，尽管有人提出，PEG 通过进入细胞并直接与线粒体等细胞器相互作用，进一步增强其膜完整性，从而改善其功能。我们还推测，将切片短暂暴露于未通气体且未添加营养源的 PEG 水溶液（1 分钟），是否通过缺血 - 缺氧预处理现象提供了一定程度的神经保护。

虽然 PEG 无疑能促进膜的重新密封，但很可能并非所有神经元突起（尤其是那些残留较小膜破损的突起）都能通过这种处理完全密封。膜的重新密封在超过 31°C 的温度下发生，在 60 分钟内可实现显著的重新密封。因此，我们尝试在低温下初步制备切片并随后暴露于 PEG 后，将其转移到 35°C 的解剖用人工脑脊液（DaCSF）中，以重新密封残留的膜破损。考虑到此时切片仍有膜破损，我们认为在解剖用人工脑脊液（DaCSF）中进行初始加热是谨慎的，因为该溶液设计为含有最低量的钠离子和较低水平的钙离子。随后，将它们在 35°C 的记录用人工脑脊液（RaCSF）中再孵育 30 分钟，该溶液含有生理离子浓度。我们通过实验证实，与在室温下孵育相比，切片后的加热对细胞活力有有益的影响。

️ 五、总结

在本文中，我们描述了一种生成小鼠体外脊髓切片制备的方案，该方案允许使用全细胞膜片钳技术研究已识别的成年腰部运动神经元。此外，由于运动神经元作为一类细胞具有选择性脆弱性，针对体外运动神经元记录优化的制备方法应能在研究其他脊髓神经元时表现出稳健性。尽管我们已经开发了一种经验优化的方法，但其他参数组合可能进一步改进的空间无疑仍然存在。随着遗传方法的出现，使用小鼠作为脊髓研究的模型正变得越来越普遍。转基因方法具有广泛的优势，我们相信这种制备方法将成为研究运动神经元特性和脊髓运动网络的出生后发育，以及小鼠疾病模型的宝贵工具。具体而言，这种制备方法将有助于在肌萎缩侧索硬化（ALS）等成年发病的神经退行性疾病小鼠模型中，对成年运动神经元的内在特性进行药理学研究和表征。

公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810