Rink Amide树脂结构对多肽合成的影响研究

摘要：研究了Rink Amide树脂取代度、溶胀度及肽链的长度不同对肽合成收率的影响, 并对影响Rink Amide树脂溶胀度的因素进行了研究, 结果表明, 合成长肽时低取代度、高溶胀度的Rink Amide树脂能获得较好的肽收率。

️关键词： 固相多肽合成 Rink Amide树脂 Fmoc-氨基酸 溶胀度

Rink Amide树脂是苯乙烯-二乙烯苯共聚物的一种衍生物, 是一种带有酸敏性官能团的树脂, 被广泛用于制备多种氨基化合物[1]及其衍生物, 还作为固相载体用于合成C端为氨基的多肽。其结构式如图1所示

图1 Rink Amide树脂结构

Rink Amide树脂用于肽合成, 采用的是芴甲氧羰基 (Fmoc) 合成机制, 该方法具有反应条件温和、副反应少、产率高等优点[1], 肽段最后用三氟乙酸 (TFA) /二氯甲烷 (DCM) 就可以从Rink Amide树脂上切除, 避免了用其他载体树脂合成时, 需采用强酸 (如液态氟化氢) 进行切除可能产生的氨基酰化等副反应[2], 被广泛用于各种活性多肽的合成[3, 4]。因为Rink Amide树脂自身带有Fmoc基团, 第一个氨基酸与树脂的连接方法与后续其它氨基酸相同 (大多数固相合成载体需要特殊的工艺与第一个氨基酸连接) , 非常利于自动化生产, 因而广受欢迎。

固相多肽合成过程中对固相载体的选择非常关键, 它不仅关系到肽合成反应速度的快慢, 对合成目标肽的纯度, 目标肽的收率都有重要的影响, 对工业化生产多肽的成本有重要影响, 正确选择载体是固相合成法成功的关键[5]。本研究以Rink Amide树脂为固相载体, 采用相同的Fmoc肽合成机制, 探讨了相同反应条件下不同树脂溶胀度、不同树脂取代度对肽合成收率的影响, 以及肽链长度不同对肽合成收率的影响, 并对影响Rink Amide树脂溶胀度的因素进行了探讨。

️2.1肽链氨基酸排列顺序

序列一: (C端) -Cys–Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly (N端) ;

序列二: (C端) -Trp-Pro-Leu-Gly (N端) 。

️2.2试验

️2.2.1分析与检测

用茚三酮试剂显色 (Kaiser) 法[6]定性检测反应进行的程度, 判断各步接肽的终点;通过检测肽树脂的增重量来计算肽的收率。

️2.2.2操作

️2.2.2.1 Rink Amide树脂的预处理

精确称取10.00g干燥的Rink Amide树脂 (7mmol) , 用70m L DMF浸泡溶胀30min, 抽干。

️2.2.2.2脱除保护基Fmoc

控温25℃~28℃加入25%哌啶的DMF溶液60m L, 搅拌反应5min, 抽干;仍用上述同样量的溶液25℃~28℃下再搅拌反应30min, 抽干;之后依次以50m L的DMF洗涤树脂3次, 50m L的异丙醇洗涤树脂3次, 50m L的DMF洗涤树脂3次, 抽去溶剂备用。

️2.2.2.3肽键的形成 (活化酯法)

将Fmoc-氨基酸 (17.5mmol) 、HBTU (17.5mmol) 、HOBt (17.5mmol) 溶于50m L DMF中, 然后加入装有2.2.4.2所制树脂的容器中, 再加入DIPEA (28mmol) , 密封反应容器, 控温25℃~28℃搅拌反应, 在反应过程中, 用茚三酮显色法监测反应进行程度, 当树脂呈无色透明状时, 表示缩合反应已完成。之后依次以50m L的DMF洗涤树脂3次, 50m L的异丙醇洗涤树脂3次, 50m L的DMF洗涤树脂3次, 抽去溶剂备用。依次重复2.2.4.2和2.2.4.3直到完成整条肽链的连接。

️2.2.2.4肽树脂的后处理

在25℃~28℃下加入25%哌啶的DMF溶液60m L, 反应5min, 抽干;仍用60m L 25%哌啶的DMF溶液在25℃~28℃下反应40min, 抽干。之后依次以50m L的DMF洗涤树脂3次, 50m L的DCM洗涤树脂3次, 50m L的甲醇洗涤树脂3次, 50m L的DCM洗涤树脂3次, 50m L的甲醇洗涤树脂3次, 抽干;25℃~28℃下真空干燥至恒重 (约15h以上) , 干燥剂为P2O5, 之后, 称量保护肽树脂的总重量。

️2.2.2.5计算肽收率

理论增重计算:理论肽增重 (g) =保护肽分子量×原料树脂取代度×原料树脂重量

️2.2.2.6溶胀度检测

用天平准确称取两份1.00g Rink Amide树脂, 分别放入具塞量筒中, 并分别加入DCM和DMF至满刻度并除去气泡, 盖紧塞子, 使树脂充分溶胀4h;不断将量筒震荡至树脂堆积紧密, 树脂的体积不再变化为止, 读其体积数。

️3.1 Rink Amide树脂取代度不同对肽收率的影响

Rink Amide树脂溶胀度相同、取代度不同, 肽合成反应条件相同, 肽序列相同 (序列一) , 肽收率结果见表1。

表1 Rink Amide树脂取代度对肽收率的影响

从表1的试验数据可看出, 溶胀度相同的Rink Amide树脂, 取代度低的树脂肽收率高于取代度高的树脂。因为溶胀度相同的Rink Amide树脂取代度越高相同的空间网格内需容纳的肽链越多, 随着肽链的增长, 取代度高的树脂内部空间网格变得更加拥挤, 加剧了肽链之间的相互纠结、聚合, 不便于反应物进入载体的内部, 缩合反应速度减慢;肽链的聚合导致部分反应活性点被屏蔽, 造成茚三酮检测假阴性, 缩合效率降低, 影响了肽的收率。

️3.2 Rink Amide树脂溶胀度对肽收率的影响

3组Rink Amide树脂取代度相同、溶胀度不同, 肽合成反应条件相同, 肽序列相同 (序列一) , 肽收率结果见表2。

表2 Rink Amide树脂溶胀度对肽收率的影响

从表2的试验数据可看出, 取代度相同的Rink Amide树脂溶胀度高的树脂肽收率均高于溶胀度低的树脂, 这是因为固相载体树脂的溶胀度越大, 树脂内部的网格空间越大, 树脂表面和树脂内部反应基与溶液中的活性基团的碰撞机会越多, 反应越接近均相状态, 越有利于反应的进行, 同时高溶胀时便于洗涤排除球内所含副产品和过剩的溶剂, 有利于提高目标肽的纯度和收率。

️3.3肽链长度不同对Rink Amide树脂合成肽收率的影响

两组取代度相近、溶胀度相近的Rink Amide树脂用相同的肽合成反应条件分别合成长度不同的肽, 肽收率结果见表3。

表3 肽链长度对Rink Amide树脂合成肽收率的影响

从表3的试验数据可看出, 相同的Rink Amide树脂合成的肽链越长, 肽的收率越低;取代度不同的Rink Amide树脂在合成短肽时收率相差不大。

️3.4影响Rink Amide树脂溶胀度的因素3.4.1 Rink Amide树脂溶胀度与取代度的关系

️3.4.1 Rink Amide树脂溶胀度与取代度的关系

样品均为100mesh~200mesh、1%DVB的Rink Amide树脂, 仅取代度不同, 检测结果列于图2。

从图2可以看出, 交联度相同、粒度相同的Rink Amide树脂在DCM中的溶胀度随树脂取代度的增大而迅速变小, 降低幅度较大;在DMF中的溶胀度随树脂取代度的增大缓慢变小, 降低幅度较小;而且树脂在DCM中的溶胀度大于在DMF中的溶胀度。树脂在不同的溶剂中的溶胀性差异与两种溶剂的极性有关。

图2 Rink Amide树脂在DCM和DMF中的溶胀度与取代度关系

️3.4.2 Rink Amide树脂的溶胀度与粒度关系

样品均为1%DVB Rink Amide树脂, 仅粒度不同, 检测结果列于表4。

表4 Rink Amide树脂的溶胀度与粒度关系

从表4的数据可以看出取代度相同、交联度相同、仅粒度不同的Rink Amide树脂, 粒径大的树脂溶胀度普遍小于粒径小的树脂。

在固相多肽合成过程中固相载体树脂的溶胀状况对缩合试剂及羧基组分的自由扩散, 对肽链之间的聚集等与缩合反应有关的因素有明显的影响[7], 树脂的溶胀越大, 反应体系越接近于液相反应状态, 有利于反应进行;但是树脂溶胀过大又带来树脂强度降低的问题, 容易导致树脂破碎, 所以当前普遍采用1%DVB交联的聚苯乙烯树脂既兼顾了树脂的强度, 又兼顾了溶胀度。

️4结论

Rink Amide树脂的取代度和溶胀度以及肽链的长度都对肽合成的收率有影响, 而树脂的粒度、交联度、取代度又对树脂的溶胀度有影响, 因此, 在肽合成时应根据目标肽的长度合理选择Rink Amide树脂;合成中、长肽时宜选用低交联 (1%DVB) 、小粒度 (200mesh~400mesh) 、低取代度的Rink Amide树脂, 以确保多肽合成反应的顺利进行和较高的目标肽纯度及收率;在合成短肽时宜选用低交联 (1%DVB) 、普通粒度 (100mesh~200mesh) 、高取代度的Rink Amide树脂, 以提高合成效率。

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