北林转录+代谢+微生物揭示杨树黄酮驱动假单胞菌氮利用率分子机制

根系微生物组变异对植物功能性状的影响日益被人们所认识，但调控这种变异的遗传机制却很少被研究。2025年2月7日，北京林业大学生物科学与技术学院张德强/谢剑波团队在Nature Communications 期刊在线发表了题为 “Flavones enrich rhizosphere Pseudomonas to enhance nitrogen utilization and secondary root growth in Populus” 的研究论文。本研究揭示了植物-代谢物-微生物调控模式对杨树适应性的影响，并彻底解码了苜蓿素的关键调控机制，为植物关键代谢物与转录组和根际微生物的相互作用提供了见解。

️1.土壤微生物群落对杨树生长的促进作用

为了评估根际微生物群落对植物适应性的重要性，在低氮、未经灭菌的自然混合土壤中对来自四个分类群（️白杨派、黑杨派、青杨派和胡杨派）九种代表性杨树进行盆栽实验。三个月后，检测11个表型（株高、地径、地上部生物量、根生物量、根长、叶长、叶宽、叶面积、叶数、叶绿素含量和叶片氮含量）。结果显示，白杨派的苗木生物量最高，其次是黑杨派和青杨派，而胡杨派表现出最低的生物量。不同物种之间的生 长参数存在差异。生长迅速的毛白杨Lumao 50（LM50）的地上部生物量是生长最慢的胡杨H（Peu-H）的14.02倍。为了探究基因型介导的土壤微生物群落是否参与了杨树生长的差异，对生长旺盛的LM50和生长较差的Peu-H进行了土壤移植实验。当Peu-H被移植到LM50生长过的土壤中时，Peu-H的地上部生物量显著增加（图1A、B）。相反，当LM50被移植到Peu-H生长过的土壤中时，LM50的生长受到显著抑制（图1A、B）。灭菌土壤中，LM50地上生物量比Peu-H多7.37克，在Peu-H生长过的土壤中扩大到8.29克，在LM50生长过的土壤中扩大到10.26克（图1A、B）。结果表明，植物相关微生物群落对杨树生长有积极影响，但这种影响的程度取决于植物基因型。具体来说，由生长旺盛基因型招募的土壤微生物群落更有利于植物生长，长较弱基因型招募的土壤微生物群落促进效应较弱。

图1 杨树根际招募特定微生物类群可能与植物生长性能有关

️2.杨树根际微生物组成的分类特征

为评价杨树不同基因型对土壤微生物组组成和功能潜力的影响，采集了根际外土壤和根际土样品。对不同样品类型（根际外土壤和根际土壤）的9种杨树细菌群落组成进行了16s扩增子测序。胡杨派根际微生物具有最高的Shannon多样性，其次是黑杨派、青杨派和白杨派。根际外土样间无显著差异。根际微生物组的组成变化受22个特定菌门相对丰度的显著变化驱动(图1C)。属水平上，胡杨派中鉴定出109个特定标记，在黑杨派中鉴定出90个，在青杨派中鉴定出45个，在白杨派中鉴定出37个（图1C）。白杨派中检测到的37个标记属占相对丰度的41.15%，其中假单胞菌（Pseudomonas）的丰度最高，为13.77%。这些结果表明，基因型特性通过选择特定的微生物类群来建立根际细菌群落。

️3.基因表达、类黄酮生产和根际微生物群落的共表达网络

为了探索杨树基因表达与根际微生物招募之间的相关性，对九种杨树的根进行了转录组测序。基于微生物（图1D、G）、表型（图1E、H）和转录组（图1F、I）的主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）清晰地将九种杨树划分为四个不同的亚组，每个亚组都与一个特定的分类群相关。表明微生物组成、生长特征和基因表达都显著受到基因型的影响。此外，功能富集分析显示，四个分类群之间的差异表达基因显著富集在与黄酮类代谢相关的功能。因此，作者️假设杨树的功能基因通过调节黄酮类物质的合成来介导根际微生物群落组成和多样性的变化。

接下来，对九种杨树的根定量分析了129种黄酮类物质。kmeans分析根据黄酮类物质的积累模式将它们分为六个聚类。通过皮尔逊相关性来寻找与每个聚类中黄酮类物质显著相关的DEGs和ASVs（图2）。所有聚类中，共有17,698个DEGs和2579个ASVs与至少一种黄酮类物质共表达。这些聚类中的基因、黄酮类物质和微生物表现出与特定分类群相关的独特丰度模式，例如胡杨派（聚类I）、白杨派（聚类IV）和黑杨派（聚类V）。总的来说，这些结果表明基因表达、黄酮类物质积累和根际微生物富集的趋势显示出显著的分类群特异性。

为了研究共表达网络是否能够为杨树中的基因-黄酮类物质-微生物调控网络提供见解，在网络中识别了147个编码酶的基因，这些酶催化黄酮类生物合成途径中的十二个酶促反应步骤。在聚类IV中发现了13个查尔酮合成酶（CHS）基因中的4个以及所有3个黄酮类3-羟化酶（F3'H）基因，其中F3'H在催化黄烷酮向异鼠李素和二氢山柰酚向二氢槲皮素的转化中起着关键作用，这两种化合物是黄酮类和黄烷醇生物合成中的关键前体物质。相应地，在聚类IV中观察到了11种黄酮类物质（11/21）。在聚类IV中存在26个bHLH和38个MYB转录因子。这两个基因家族的成员通常协同调节黄酮类物质的生物合成。此外，在聚类V中，两种黄酮醇合成酶（FLS）基因和7种黄酮醇（7/16）高度相关。总之，我们的网络数据包含大量与黄酮类合成相关的基因，表明共表达网络有助于阐明微生物招募的遗传机制并识别候选基因。

图2 转录组、代谢组和微生物组的共表达网络

️4.根际微生物组成与基因表达、黄酮类化合物积累和杨树生长性能一致

因为白杨派和胡杨派两个分类群表现出了最为对比鲜明的生长表现，因此选择了两个分类群中达到峰值的聚类IV和聚类I进行分析。功能富集分析显示，聚类I中的基因主要与管家功能相关，如遗传信息处理、核糖体生物合成和错配修复。相比之下，️聚类IV中的基因（在白杨派中富集）涉及能量和物质循环（光合生物中的碳固定、氮代谢和能量代谢），以及黄酮类代谢。因此，我们随后选择了聚类IV进行进一步分析。我们发现，聚类IV中的ASVs主要属于变形菌门，拟杆菌门，其中假单胞菌科、几丁质菌科、黄单胞菌科和伯克霍尔德菌科的数量最多，这些分类群在白杨派中特别富集。在代谢物聚类中，黄酮类物质中的苜蓿素和芹菜素及其衍生物是白杨派中最富集的代谢物。芹菜素能够招募根瘤菌、草酸杆菌科和假单胞菌等有益细菌，增强植物的氮吸收能力。苜蓿素与芹菜素结构相似，并且与芹菜素共享相同的KEGG通路（ko00944），这表明苜蓿素可能具有与芹菜素相似的生物学功能（图3B）。黄酮类代谢（苯丙氨酸代谢、苯丙素生物合成和黄酮类生物合成）中基因的表达与黄酮类物质的积累呈显著正相关。黄酮类物质的积累与假单胞菌科、伯克霍尔德菌科、弧菌科和黄单胞菌科的ASVs相关，其中假单胞菌科的ASVs数量最多。值得注意的是，假单胞菌科是与黄酮类模块和黄酮类相关基因模块相关性最高的科之一（图3D）。假单胞菌科的相对丰度从根际外土壤的0.86%增加到白杨派根际中的最高值（13.78%），在白杨派中特别富集，并且与杨树生长相关（图3E）。特别是，在属水平上，假单胞菌属已被证明在固氮、磷溶解、生长激素分泌和抗菌活性方面具有有益潜力，并且与植物生长特征强相关（图3F）。总的来说，这些结果表明，特定的细菌分类群由于白杨派的特性而变得富集，并且与基因表达、黄酮类物质积累和植物生长相关。

图3 基因表达和黄酮类化合物积累与根际微生物组成和杨树生长性能有关

️5.苜蓿素和芹菜素介导的假单胞菌促进杨树氮素利用和次生根生长

作者从白杨派（Pto-M、84K、Pal-Y和LM50）的根际土壤样本中分离出11株假单胞菌。7株具有固氮能力，并携带固氮基因（nifH），8株分泌吲哚-3-乙酸。鞭毛菌，如假单胞菌，可以通过群集运动向植物根部移动，这一过程的成功决定了根定植的效率。值得注意的是，在5um苜蓿素和100um芹菜素存在的情况下，Pto1、Pto5和Pto10增强了群体运动性（图4A）。qRT-PCR分析表明鞭毛相关基因（motA、fliG和bifA）和生物膜形成相关基因algU被激活，这可能是细菌成功定植的关键(图4B)。为了研究假单胞菌分离株对杨树适应性的潜在影响，我们接种了三种单独的菌株，并构建了合成群落（SynComs：Pto1、Pto5和Pto10）。利用15N同位素标记，追踪了杨树从土壤中吸收的氮，而微生物从空气中固定的氮则保持未标记。接种的菌株显著增加了杨树（84K）的地上部生物量、根生物量和叶片氮含量（图4C、D）。接种后，接种菌株的叶片15N比率下降，表明假单胞菌通过生物固氮促进了杨树的氮吸收。无菌的贫氮培养基中，接种Pto1后，杨树侧根的数量和长度分别增加了9.92倍和2.88倍（图4E、F）。氮供应充足的培养基中，Pto1对杨树生长和侧根诱导的促进作用减弱（图4F）。️这些结果表明，假单胞菌的功能可能依赖于特定的氮饥饿信号与植物反应之间的相互作用。

图4 黄酮类介导的假单胞菌促进杨树氮素吸收和次生根生长

️6.Pto1通过分泌IAA诱导拟南芥中介导的LR通路

双子叶植物的根系结构复杂，包含多种类型的次生根（SRs），包括侧根（LRs）和不定侧根（adLRs），它们由不同的遗传途径调控。为了阐明Pto1接种后诱导的次生根性质，对拟南芥三突变体的根系结构进行了分析，该突变体在侧根（LR）形成方面存在缺陷，同时还分析了拟南芥双突变体，该突变体在不定侧根（adLR）和不定根（AR）形成方面存在缺陷。在接种Pto1的突变体中，7天时未观察到可见的侧根（图4H、I）。相反，突变体的侧根数量显著增加，与野生型根在Pto1接种后观察到的增加相当。当在培养基中添加IAA时，拟南芥根的发育模式与Pto1接种后的结果相似。然而，生长素抑制剂TIBA阻碍了所有拟南芥品系的侧根生长，无论是否存在Pto1。这些结果表明，️Pto1分泌的IAA在诱导拟南芥中介导的侧根途径中起着关键作用。

️7.PopGL3调节tricin合成招募假单胞菌

对共表达网络分析，确定与黄酮生物合成相关的调节因子。在富含芹菜素和苜蓿素的簇IV中，鉴定出bHLH转录因子家族的成员bHLH1（即GL3）。与黄酮和与类黄酮生物合成相关的基因有很强的共表达。DAP-seq实验显示，PopGL3可以调节参与类黄酮合成的过氧化物酶2 （PopPA2）、PopF3'H、磷酸2-氧-3-脱氧七酸醛缩酶（PopDAHP）、肉桂酰辅酶还原酶1 （PopCCR1）和四氢小檗碱氧化酶（PopTHB）的转录（图5A-C）。组成性表达PopGL3或PopCHS4可激活PopF3'H和黄酮合成酶（PopFNS）的转录，并在PopCHS4- oe（查尔酮合成酶催化多支黄酮途径的第一步）和PopGL3- oe的根际释放更多的苜蓿素 (图5 E、F)。

通过15N同位素稀释法测定了不同杨树基因型中生物固氮对氮营养的贡献。在未经灭菌的自然土壤混合物中生长两个月后，PopGL3-OE和PopCHS4-OE植物显示出生物量增加和叶片氮积累增加（图5D、G）。与野生型相比，转基因植物根际微生物的BNF贡献增加。相反，在灭菌土壤中，所有基因型生长较弱，生物量没有差异。通过扩增子测序来阐明不同杨树基因型之间BNF差异的原因。结果表明，转基因（PopGL3-OE和PopCHS4-OE）植物重塑了根际微生物组成，并显著富集了假单胞菌（图5H、I）。实验结果表明，转基因植物中假单胞菌的增加部分是由于大多数其他细菌类群的绝对减少，但不排除通过苜蓿素途径对假单胞菌的正向选择。为了证实转基因植物中假单胞菌的根际定殖增加，用红色荧光蛋白（RFP）基因标记了Pto1，并利用共聚焦显微镜对不同基因型的根组织定殖进行了成像。我在PopGL3-OE和PopCHS4-OE植物的根中，通过共聚焦显微镜观察到显著增强的定殖和增加的荧光密度（图6A、B）。此外，菌落形成单位（CFUs）统计进一步证实了这一结论（图6C）。总之，PopGL3是黄酮类生物合成的调控因子，通过分泌苜蓿素招募假单胞菌，以促进杨树的生长和氮吸收。综合来看，这些数据表明，在受控的实验室环境中，且在没有其他微生物的情况下，PopGL3-OE植物中假单胞菌数量的增加伴随着定殖的增加，这种增加可能对杨树的适应性是有益的。

图5 PopGL3调节苜蓿素合成招募假单胞菌

作者收集了来自四个分类群（白杨派、黑杨派、青杨派和胡杨派）的九种杨属植物的根和根际土壤，生成了根的代谢物和转录数据以及根际的微生物数据，并进行了综合多组学分析。与生长表现较差的杨树相比，生长旺盛的白杨派杨树的根际富集了更多的假单胞菌。此外，作者证实假单胞菌与苜蓿素芹菜素生物合成密切相关，并鉴定出GLABRA3（GL3）基因对苜蓿素分泌至关重要。通过组成型转录PopGL3和查尔酮合成酶（PopCHS4），可以增加根际假单胞菌的定殖，并进一步增强杨树在氮贫瘠土壤中的生长、氮获取能力和侧根发育。