Open Ephys IO 板不同的 θ 框架在大鼠海马中共存，并在记忆引导和新奇任务期间进行协调

海马放电由内部记忆过程和外部感官线索控制的 θ 序列组成，但这些计算是如何协调的尚不完全清楚。虽然 θ 活动通常被研究为一种独特的相干振荡，但它是不同节律发生器之间复杂相互作用的结果。在这里，通过分离三个不同电流发生器中的海马 θ 活动，我们发现了具有可变 θ 频率和相位耦合的时期，这表明 θ 发生器之间存在灵活的相互作用。我们发现，高度同步的 θ 节律时期优先发生在需要内部记忆表征和传入感官信息之间协调的行为任务期间。此外，我们发现 γ 振荡与特定的 θ 发生器有关，并且 θ-γ 耦合的强度可以预测 θ 发生器之间的同步。我们提出了一种基于不同 θ 框架的灵活协调来分离或整合海马计算的机制，以满足认知需求。

️ 一、介绍

海马结构灵活地结合了由外部环境线索刺激驱动的空间导航计算，以及依赖于内部生成的放电序列的记忆处理。大脑网络中特有的振荡活动模式已被提出作为一种组织不同计算的机制，并根据认知需求将它们整合或分离为振荡周期。在海马体中，θ 和 γ 振荡是自由活动动物记录到的最突出的节律。海马体的理论和实验工作已将环境线索的处理和记忆的编码与内嗅皮层 (EC) 的输入在 θ 周期的特定阶段到达 CA1 联系起来，而记忆的检索则与 CA3 输出在周期的不同阶段到达 CA1 联系起来。这些区域之间的信息传递被认为发生在较慢 CA1 区 θ 节律阶段组织的不同频率的 γ 振荡中。这些 θ-γ 关联被称为跨频率耦合 (CFC)，在探索和记忆引导行为期间受到调节。最近的研究进一步表明，θ-γ 相互作用可能在整个海马 θ 节律中以周期性方式变化。然而，已知源自海马不同解剖层的 θ 振荡可以共存，因此，theta-gamma 相互作用需要在多个节律发生器的背景下进行解释。

除了经典的布罗卡区输入的内侧隔膜/对角带给海马和 EC 带来整体节律之外，重要的节律发生器位于 EC 第二层 (EC2) 和第三层 (EC3)，其活动分别通过穿通通路和颞氨通路到达齿状回 (DG) 和海马本身，并且从 CA3 活动通过 Schafer 侧支到达 CA1放射层。重要的是，尽管海马中的 θ 振荡最常见的研究对象是跨海马层的独特相干振荡，表现出特征性的幅度/相位随深度变化，但研究表明 CA3 θ 节律发生器的频率和相位变化相对独立于 EC θ 输入。这些多个 θ 节律发生器和通路特异性伽马振荡如何在海马中相互作用尚不清楚。一个吸引人的可能性是，不同的 θ 振荡可能代表不同的 θ-γ 编码框架，提供分离的基础，也提供整合计算的基础。

在这里，我们研究了大鼠自由探索已知和新环境并解决 T 迷宫时海马中振荡活动的通路特异性同步功能。使用高密度电生理记录并借助源分离技术，我们表征了海马中三种不同的 theta 和三种不同的 gamma 偶极子的动态特性，它们分别起源于 CA3 Schaffer 侧支层、EC3 投射到分子层和EC2 投射到 DG 的中分子层，并发现对不同 theta-gamma 框架存在的强有力支持。使用针对 CA3 小白蛋白中间神经元的光遗传学工具，我们展示了 CA3 相关与EC 相关 theta 发生器的特定调节，证明了海马中独立的 theta 振荡。尽管如此，已识别的 theta 框架之间的相移有助于在亚秒时间尺度内以成对或三元组的方式协调它们。然后，我们描述了不同通路之间的 θ-γ 相互作用，并建立了与海马网络中同步状态的关联。在较高的 θ 同步期间，θ-γ CFC 更强，我们发现通路特定的 γ 振荡始终先于 θ 相移。最后，我们研究了这些 θ-γ 框架在情境学习中的功能作用，这种情境学习需要使用环境中发现的变化来更新现有记忆。我们发现，在将记忆中的情境表征与传入的感官信息进行比较的情况下，在错配新奇和记忆引导决策期间，θ-γ CFC 和 θ 振荡之间的协调始终较高。

️ 二、结果

️2.1 通路特异性的 θ 和 γ 振荡

我们使用线阵电极对 5 只大鼠的背部海马进行电生理记录（见材料和方法，图 1）。记录是在动物自由探索熟悉的开放场（图 1、2、3、4、5、6）、新的开放场（图 6）或 T 型迷宫（图 7）时进行的。基于独立成分分析 (ICA，图 1—图补充 1 )，使用空间辨别技术分离由不同突触通路贡献的LFP 源，我们在所有受试者中剖析了三个稳健成分 (图 1；材料和方法)。三个成分的最大电压（图 1b）和电流源密度 (CSD) 深度剖面中的偶极子（图 1c ）与海马中已知终端场的分层分布以及刺激相应通路产生的电流相匹配，如前所示。第一个成分位于放射层，其中 CA3 Schaffer 侧支/连合通路以 CA1 区域为目标（标记为 Schaffer 成分或 Sch-IC）。第二个成分与分子层(lm-IC) 中的 EC3 投射相匹配，第三个成分与从 EC2 到 DG 分子中层 (PP-IC) 的穿通通路相匹配。这三个成分被称为通路特异性 LFP 或 IC-LFP，代表了 LFP 中记录的具有不同解剖起源的突触贡献。

图 1.通路特定的局部场电位 (LFP)。( a ) 用电脉冲刺激穿通通路 (左图) 或在静息活动 (右图) 期间诱发的背侧海马 (32 个记录，每隔 100 μm 一个点) 中的电生理信号的深度分布。黑色轨迹代表 LFP，颜色映射相应的 CSD。诱发活动用于在植入过程中持续定位电极。Or，地层；pyr，锥体层；rad，放射层；lm，分子层；gc，颗粒细胞层；hil，门。( b 和 c ) 用 ICA 提取的三个通路特异性 LFP 的电压和 CSD 负荷示例，最大负荷与 str 中的相应传入层重叠。radiatum (Sch-IC)、lacunosum-moleculare (lm-IC) 和齿状回分子层 (PP-IC)。( d ) 一只代表性动物中记录电极 (箭头) 的位置。组织切片用 GFAP 抗体进行免疫染色。( e ) 三个 IC-LFP 的功率谱在受试者中取平均值，显示出在 θ 频率处有一个清晰的峰值，并且存在宽带伽马活动。( f ) 沿 pyr CA1 中记录的 LFP θ 周期的 IC-LFP 伽马振幅 (平均值±sem) 分布，其中其谷值和峰值分别与 0 和 π 弧度重合。黑色波是 θ 振荡的一个例子。彩色编码条表示相对于所有动物 (材料和方法) 中的替代分布具有统计学意义的值。( g ) 在左侧面板中，我们绘制了 IC-LFP 与 CA1 锥体层中记录的 LFP 的相干性分析结果。黑线表示统计阈值。在右侧面板中，IC-LFP 之间的相干性分析（绿线）与在每个 IC-LFP 贡献最大的层中记录的原始 LFP 通道之间的相干性进行了比较（虚线，**p<0.01，我们使用了双向方差分析来比较 IC-LFP 对之间的 θ 相干性与原始 LFP 之间的 θ 相干性，然后进行 Bonferroni 校正，F(1,12)=32.01，N = 5）。（h）CA1 锥体层中记录的 IC-LFP 和 LFP 之间的 θ 相位差。灰线表示单个 θ 波相对于 CA1 锥体 θ 波谷（在 0/2π 弧度处）的相位。平均相位用彩色粗线表示。粗线的长度表示 ICPC。

这些信号的功率谱在 θ 频率（6-10 Hz）和宽带伽马活动处显示出明显的峰值（图 1e）。CA3 和 EC3 神经元已显示分别发射与下游 Sch-IC 和 lm-IC 中离散伽马波段振荡锁定的相位，其中伽马振荡在 CA1 中记录的 θ 波相位中分离。一致性很高的是，通路特异性伽马活动分布在θ周期中，lm-IC接近θ峰值（π弧度），其次是Sch-IC（图1f），这与各自上游传入层中主要神经元的放电特性一致。同样，EC2 和 EC3 中的内嗅主细胞相对于θ振荡以反相方式放电，因此，我们记录中的 PP-IC 和 lm-IC 中的大振幅伽马振荡偏移了 180°（图1f）。这些结果支持使用多通道记录和源分离工具来研究海马结构多层中θ和伽马电流发生器之间的相互作用。

首先将这些成分的相对相位和相干性与 CA1 锥体层记录的 θ 振荡进行比较，后者通常用作海马中时间相互作用的参考。我们测量了相干性和周期间相位聚类指数 (ICPC)，除了测量相干性之外，它还逐个周期计算信号之间的相位差（见材料和方法）。所有 IC-LFP 都表现出与 LFP 信号的显著相干性，主要在 θ 范围内（及其第一个谐波，图 1g）。类似地，IC-LFP 对之间的 θ 频率相干性很高（Sch-lm、Sch-PP 和 lm-PP 分别为 0.41、0.31、0.61，图 1g），EC 相关发电机之间的相干性较大（p<0.0001，经 Greenhouse-Geisser 校正自由度的方差分析，F(1.091, 4.363)=89.33）。为了说明源分离分析（ICA）对这些结果的贡献，我们将 IC-LFP 之间的相干性与对每个 IC-LFP 贡献最大的地点记录的 LFP 信号的相干性进行了比较（即分别为 Sch-IC、lm-IC 和 PP-IC 的str. radiatum、lacunosum-moleculare和hilus ；图 1g，虚线）。该比较表明，不同频带的原始 LFP 之间的相干性更高，这可能是由于通道之间的体积传导所致，而 IC-LFP 中不存在这种传导。对于 θ 波段，差异在放射层中最为明显，其中 IC-LFP 之间的 θ 相干性明显较低（图 1g）。所有区域的伽马波段的差异也很明显，这将与下面的进一步分析有关。请注意，此时高度相干信号的提取与 ICA 完全兼容。该方法可找到空间分布的成分，并且只需要它们的时间协变（即时间抖动和/或幅度变化）有很小的差异。因此，ICA 允许分离源，即使它们之间存在高度相干性（参见材料和方法）。

ICPC 分析证实了相干性结果，表明 theta 范围与参考 LFP 信号存在显著耦合（Sch-IC/lm-IC/PP-IC 与 CA1 LFP 分别为 ICPC = 0.50/0.73/0.61，p<0.0001，替代检验），还显示了跨层的特征相移（Sch-IC、lm-IC 和 PP-IC 分别为 π/2、0.8π 和 1.1π 弧度；图 1h）。有趣的是，IC-LFP 中 theta 振荡之间缺乏更接近单位的相干性，这已经表明不同的 theta 电流发生器共存且具有一定程度的独立性，而不是人为地将独特的 theta 节律分解为空间隔离的分量。在后者中，振荡之间的相干性应该是最大的，因为它们将是一个波的三个分量。

️2.2 不同的 θ 框架在背侧海马中共存

为了提供 θ 电流发生器之间独立性的直接证据，我们接下来使用了光遗传学方法（图 2）。使用转基因大鼠 cre 系 (LE-TG[Pvalb-iCre]2Ottc, NIDA, USA) 和腺相关病毒 (AAV1-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-eYFP-WPRE-hGH, Penn Vector Core, USA) 注射到背部 CA3 区（图 2a），我们在小清蛋白阳性 (PV+) 中间神经元中表达兴奋性通道视紫红质-2 (ChR2)（图 2b，材料和方法）。动物 (n = 3) 双侧植入针对背部 CA3 的光纤，并像以前一样进行多通道电生理记录（图 1），以检验以下假设：通过激活 CA3 PV 中间神经元和降低 Schaffer 侧支输出，海马 θ 发生器可以独立调节。如图2c-d所示，在自由探索开阔场的动物身上，蓝光照射 (460 nm) 显著且明确地降低了 Sch-IC 中的 θ 功率和相应的通路特异性低伽马振荡。相反，lm-IC 和 PP-IC 中的振荡活动（功率和峰值频率）得以保留（图 2c）。这一发现在所有动物中都具有高度稳定性（图 2e）。特别是在 Sch-IC 中 θ 功率的调节以及三个发生器中峰值 θ 频率的保留，最终证明了 CA3 和 EC 中存在独立的 θ 振荡器。

图 2.不同的 θ 框架在背侧海马中共存。( a ) 病毒注射（左）、光纤和多通道电极植入（中）以及实验装置和刺激方案（右）的示意图。( b ) 冠状切片的代表性图像，证实了背部 CA3 区 PV 中间神经元中 ChR2 感染的特异性。左图为低倍放大图像，显示重叠的 DAPI 染色（蓝色）、PV+ 免疫染色（红色）和 ChR2-eYFP 表达（绿色）。右图为 CA3 区域的高倍放大图像，显示 PV+ 免疫染色（红色）、ChR2-eYFP 表达（绿色）及其共定位。白色箭头指向双 PV+ 和 eYFP+ 中间神经元。( c ) PV 中间神经元的光遗传学操控。在关灯（黑色轨迹）和开灯（彩色轨迹）条件下 IC-LFP 的功率谱分析（平均值 ± sem）。蓝光 (470 nm) 照明选择性地降低了 Sch-IC 中的 θ 和慢伽马功率。为了便于观察，请注意低频 (<20 Hz) 和高频 (>20 Hz) 的不同 y 轴刻度。( d ) 刺激过程中 Sch-IC 中 θ 节律变化的代表性示例。蓝线代表光脉冲。( e ) 对照组 (灰条) 和光刺激期间 θ (左) 和慢伽马功率 (右) 之间的统计比较 (彩条；*p<0.05，配对 t 检验，t = 7.88/7.34 对于 θ/gamma Sch-IC，N = 3)。黑线代表不同的受试者。( f ) 原始和 θ 滤波的 IC-LFP 的轨迹，显示其节律之间具有高 (左) 和低 (右) 相位锁定的时期。指向每个 IC-LFP 中 θ 周期峰值的三角形（如前所述用颜色区分）用于突出显示相位差的变化。（g）组分对之间或三个 IC-LFP 同时每个 θ 周期的 ICPC 值分布（平均值±sem）。（h）三个 IC-LFP（绿线）之间以及原始 LFP 之间的 ICPC 值分布。（i）ICPC 变化的动态。y 轴表示两个周期之间绝对值的平均 ICPC 差异，x 轴表示它们出现之间的时间差。连续周期显示出比时间间隔达 0.75 秒的周期更相似的 ICPC 值。

接下来，我们更详细地研究了三个 IC-LFP θ 频率之间的功能相互作用。为了将 θ 相位估计的误差降低到 θ 周期的 1% 以下，我们仅选择 θ 功率比 delta（1-4 Hz）活动高四倍的时期进行进一步分析（材料和方法以及图 1—图补充 2对此阈值进行数学验证）。如从图 1g 和 h中的结果所预期的那样，通路之间的 θ 相互作用并不是随时间恒定的，而是呈现出高同步和低同步的时期（图 2f）。为了深入了解这些状态，我们计算了每个 θ 周期的动态 ICPC，测量 θ 振荡相对于前一个和连续周期的相位关系变化（材料和方法，图 1—图补充 3）。同时测量了所有 IC-LFP 对和三个信号的动态 ICPC（图 2g、图 2—图补充 1）。所有动物的 ICPC 分布显示出接近完美相位锁定的峰值，但具有低同步时期的重要尾部，大约 20% 的周期的 ICPC 低于 0.8。同样，在 PP-IC 和 lm-IC 之间发现最高的同步性，这与相干性分析一致（图 1g），并且与这些发生器可能起源于同一皮质区域（EC）的两个子层相一致。与我们对相干性分析所做的那样，我们还根据在str. radiatum、lacunosum-moleculare和hilus记录的原始 LFP 信号计算了 ICPC 。该分析显示，基于 LFP 的相位耦合估计值明显高于 IC-LFP（三个 IC-LFP/原始 LFP 的平均 ICPC = 0.88/0.93，p<0.01，配对 t 检验，t = 5.35，N = 5）。在 IC-LFP 信号中，完美相位锁定 (ICPC = 1) 显著降低，揭示了在原始 LFP 上测量到的杂散耦合，这可能是由于体积传导混合了源造成的。因此，通过分离源，ICA 使我们能够清楚地识别海马层间 θ 同步的变化。

在之前的分析中，我们使用三个连续的 θ 周期来计算 ICPC。我们将该值作为时间分辨率和度量的稳健估计之间的权衡。然而，最近的研究表明，海马中的 θ 动态可能会在单个周期之间快速变化。为了克服这一限制并更好地理解 θ 耦合的时间动态，我们通过将给定周期的值与前一个周期的值进行比较来分析 ICPC 随时间的变化（图 2i）。这些结果提供了一条单调上升的曲线，最长为 0.75 秒；从那时起，曲线几乎没有增加。这表明连续周期之间的耦合强度在 1 秒的数量级的时间尺度上扩展，因此预计 ICPC 在这个时间尺度上会发生动态变化。总体而言，该方法可以以一个 theta 周期的时间分辨率来表征 theta 发生器之间的时间同步，从而突出显示 theta 范围内海马通路之间耦合强度的动态变化。

️2.3 Theta-gamma CFC 反映了通路特异性相互作用

上述结果支持了 θ 波范围内不同时间帧共存以组织海马活动的观点。因此，由于 γ 波活动嵌套在 θ 波周期中，因此为多重 θ-γ 相互作用提供了可能性（图 3a）。为了进行比较，我们首先采用传统的方法分析 θ-γ 相位-振幅 CFC，以锥体层中记录的 LFP 中的 θ 作为相位参考，就像通常做的那样，并使用Tort 等，2008 年引入的调制指数 (MI) （图 3b）。该分析确定了 CA1 θ 与 CA3 起源的慢伽马波带和 EC3 起源的中伽马波带 (lm-IC；82.5 ± 4 Hz 中伽马波)之间的典型耦合。分析还揭示了 DG 中分子层中一个额外的 theta 嵌套快速伽马带 (130 ± 10 Hz)，与 EC2 输入的终端场重叠，与之前在 DG 中发现的 theta-gamma CFC 相兼容。然后，我们以 IC-LFP 中分离出的不同 theta 振荡为参考，计算了 CFC。关键的新发现是系统地观察到 IC-LFP 与 LFP 中更强的 theta-gamma CFC (图 3b )。我们进一步使用Canolty 等人，2006 年提出的替代方法测试了这些相位-幅度 CFC 的稳健性(图 3—图补充 1 )，获得了类似的结果。这个结果并不完全出乎意料，因为我们发现 LFP 中记录的、通常用作 CFC 分析参考的 θ 振荡确实是不同可变相干 θ 发生器的混合（见上图 2d-e）。

图 3.θ-γ耦合反映了通路特异性的相互作用。( a ) lm-IC 的代表性 θ 和 γ 滤波轨迹，显示伽马包络如何在同一 IC-LFP 中记录的 θ 振荡波谷（以虚线突出显示）处相位锁定，但与 CA1 锥体层（pyr CA1）中记录的振荡无关。( b ) IC-LFP 中的伽马振幅（30-250 Hz）和 pyr CA1 LFP（上图）中记录的 θ 相位的调制强度（颜色编码 MI）以及相应 IC-LFP 中的通路特定 θ（下图）。( c ) 三个 IC-LFP 和 pyr CA1 中记录的所有 θ 和 θ 振荡的区域间 CFC。每个矩形表示单个特定频率下 θ 相位和伽马振幅之间的 MI（伽马参考：Sch-IC/lm-IC/PP-IC 的慢/中/快伽马）。矩形的位置和宽度表示耦合伽马振幅的 theta 相位，颜色表示 MI（每列底部的颜色标度）。Theta 波形（黑色轨迹）被提取为相应信号中所有 theta 周期的平均值。最高 CFC 强度（红色矩形）始终出现在同一通路的 theta 和 gamma 振荡之间。（d）最大 theta-gamma CFC 对应于在同一 IC-LFP 中记录的振荡，高于任何通路间组合。左/中/右面板代表从 Sch-IC/lm-IC/PP-IC 记录的慢/中/快伽马之间的 MI（平均值 ± sem），以及所有 IC-LFP 的 theta 相位和来自 pyrCA1 的 LFP。与 pyr CA1 LFP 相反，当从相应的通路特异性生成器计算 theta 相位时，并且当 theta 和 gamma 振荡具有相同的起源时，在所有情况下均发现明显更强的 MI 值（*/**p<0.05/0.01，在相同的 theta 参考下对 MI 之间的重复测量进行单向方差分析，然后进行 Bonferroni 校正，F(1.182, 4.729)=36.16/F(1.133, 4.531)=8.649/F(1.555, 6.219)=35.32，以 Sch-IC/lm-IC/PP-IC 作为 theta 参考，N = 5）。

有人认为，在海马体伽马频率较低的情况下，测量的 θ-γ CFC 可能是由于 θ 波 和/或 θ 谐波的不对称而产生的杂散效应。然而，这种限制可以通过定义 θ 振荡来缓解，该定义考虑了其不对称性，而不是仅仅在 θ 频率应用带通滤波器。我们通过多元线性回归分析检查了数据集中 θ 不对称的影响，其中每个伽马波段的功率由 θ 功率和不对称性决定 ( 图 3—图补充 2 )。我们还将跑步速度纳入其中，因为研究表明跑步速度与海马伽马振荡的功率和频率共同变化。我们考虑了两个因素来测量 θ 不对称：每个周期上升和衰减阶段持续时间之比以及波峰和波谷持续时间之比。分析证实了 theta 功率和速度对 gamma 功率的影响，以及可忽略不计的 theta 不对称贡献。这一结果支持 CA1 中存在真正的低 gamma 活动带及其与 theta 振荡耦合的生理价值。

我们最后要问的是，通路特异性的伽马活动是否优先与同一传入通路中的θ振荡耦合，可能反映局部计算，或者在不同的通路中，从而反映通路间相互作用，或者两者兼而有之。图 3c-d中的结果显示，在同一 IC-LFP 中记录的振荡之间存在显性 CFC。因此，θ-γ CFC 主要反映通路特异性相互作用，而不是不同来源的伽马活动在分离的 θ-γ 通道中多路复用到的独特载波 θ 波。使用通路特异性 θ 参考发现的较高 θ-γ CFC 为海马中不同时间 θ 框架的共存和相关性提供了另一个迹象。

️2.4 高 theta-gamma CFC 与 theta 框架之间的同步有关

已经证明 theta 发生器可以独立调节并呈现可变的同步性（图 2）并且 gamma 嵌套是通路特异性的（图 3），接下来我们探讨了解释不同同步状态的 theta 和 gamma 特征。我们发现所有 IC-LFP 中的 theta 功率都与 ICPC 相关，较大的 theta 功率与更高同步的状态相关（图 4a、b 和 c）。有趣的是，theta 振荡的频率在 Sch-IC 中的同步状态下保持恒定，但在两个 EC 相关发生器中有所不同（图 4a）。lm-IC 和 PP-IC 中的 theta 频率随 ICPC 而增加（图 4b 和 c）。至于伽马活动，宽带功率与 theta 同步不相关（未显示），相反，窄带功率（分别为 Sch-IC/lm-IC/PP-IC 的慢/中/快伽马）则与 lm-IC 中的 ICPC 相关，但与 Sch-IC 和 PP-IC 中的 ICPC 无关（图 4b）。

图 4.将 θ 振荡表征为其同步函数。( a ) 高 (蓝色，ICPC >0.95) 和低 (红色，ICPC <0.8) θ 同步时期 IC-LFP 的功率谱。在 θ 同步期间，所有 IC-LFP 中都可以看到 θ 峰值的强烈增加，同时 lm-IC 和 PP-IC 的峰值频率右移。( b ) lm-IC 和 PP-IC 中的 θ 频率与 ICPC 相关（黑线代表统计学上显著的线性相关性；分别为 R = 0.94/0.92，p<0.05，替代检验）。所有 IC-LFP 中的 θ 功率与同步状态相关（分别为 R = 0.93/0.99/0.99，p<0.05/0.0001/0.0001）。中伽马波段与 lm-IC 相关（R = 0.96，p<0.0001），但与 Sch-IC 和 PP-IC 无关。所有途径特异性发生器中的 CFC 均随 ICPC 增加（分别为 R = 0.71/0.82/0.77，p<0.01/0.05/0.001）。相关性是根据每个 ICPC 箱的平均值计算的。对于所有图，框的中心标记表示中位数，框的底部和顶部边缘分别表示第 25 和第 75 百分位数。须延伸到不被视为异常值的最极端数据点，异常值用红色星号单独绘制。（c）多元线性回归分析，包括 θ 功率、θ 频率和速度作为预测 ICPC 的因素。条形图表示每个因素解释的方差，这些方差无法用其他变量来解释。对于所有情况，贡献都被认为是显著的（参见材料和方法）。( d ) 代表性的 theta 和 gamma 轨迹显示了两种同步状态下 CFC 和 theta 频率的差异，来自具有可比 theta 功率的记录。箭头表示 gamma 事件，虚线位于 lm-IC 的 theta 相位峰值处，以便于比较节律之间的同步性。

由于跑步速度也与海马θ功率和频率相关，我们进行了多元线性回归分析，包括跑步速度、θ功率和θ频率作为解释变量来预测ICPC（图4c）。通过这种分析，我们可以估计每个变量对ICPC的贡献，而这些贡献无法用模型中的任何其他变量来解释。我们使用了动物在熟悉的开放场地探索时记录的所有θ周期进行分析。MI未包含在多元线性回归中，因为其对于单个θ周期的值不可靠。结果证明了θ功率对ICPC值的主要影响，其中θ频率和跑步速度的贡献较低但显著（图4c，p <0.05，每个因子的beta值之间的零t检验，Bonferroni校正，材料和方法）。

最后，该分析揭示了 CFC 与 theta 同步之间的显著相关性 (图 4b 和 d )。强 theta-gamma 调制与高 ICPC 值相关，而在低同步时期发现弱或几乎不存在的 CFC。请注意，如上所述，在本分析中仅选择了具有高 theta 功率活动的周期 (图 4d )，因此信号的功率不会影响对其相位的估计 (图 1—图补充 2 )，从而防止在同步测量中引入任何偏差 (图 1—图补充 2，材料和方法)。该结果表明通路内 CFC 与通路间同步相关。

️2.5 伽马振荡始终先于西塔波

θ 和 gamma 振荡反映了发生在不同时间尺度上的两个过程的细胞外增加的兴奋性和抑制性突触和活跃树突电流。我们假设 CFC 可能反映了一种机制，通过这种机制，快速兴奋-抑制相互作用组织了我们分析中发现的不同 θ 框架中主要细胞的活动。然后，我们在两个频率之间的相互作用中寻找方向性的迹象，并基于相位斜率指数计算了跨频率方向性指数，以计算两个信号之间的相位差。该方法专门用于估计信噪比差异较大的信号之间的方向性，如 θ 和 gamma 频率，在这些条件下表现出比 Granger 因果关系等传统方法更有效。在 CFD 中，当慢振荡的相位始终领先于快振荡的幅度时，也就是说，当 theta 相位和下一次伽马活动爆发之间的时间差为常数时，theta 相位和伽马幅度之间的相位差随频率的增加会导致相位谱的正斜率（即正 CFD 值）。当快振荡的幅度始终领先于慢振荡的相位时，或者在我们的分析中，当从伽马活动到下一个 theta 周期的延迟为常数时，斜率为负。如图5a中的组数据和图 5—图补充 1中的单个动物所示，CFD 导致嵌套在相应 IC-LFP 中的 theta 振荡中的特定伽马波段为负值（幅度-相位耦合，APC）。这种伽马幅度到 theta 相位的方向性是由对伽马活动到 theta 相位的一致预期给出的。图 5b是PP-IC 中 gamma 到 theta 方向性的典型示例。gamma 到 theta 的延迟几乎是固定的，而相反方向（theta 到 gamma）的延迟则变化很大。需要注意的是，CFD 并非没有局限性，与 CFC 一样，谐波和 theta 不对称的存在可能会导致方向性测量结果不准确。

图 5.CFD 分析表明，伽马活动会调节θ的相位.( a ) 通路特异性信号的 CFD 分析表明，具有最高 CFC（圆圈区域）的 θ-γ 振荡对具有最大负值 (APC)。这些结果表明，γ 振荡会调节 θ 相。( b ) PP-IC 中 γ-θ 耦合的示例。从 γ 活动最大值到 θ 峰值的时间差几乎是固定的 (APC，蓝色箭头)，而从 θ 到 γ 的距离在每个周期中都会变化 (相位-幅度耦合，PAC；红色箭头)。( c ) 使用来自不同海马层的原始 LFP 进行与 ( a )中相同的 CFD 分析证实了 APC 的方向性。( d ) 使用 IC-LFP 和 LFP 比较 CFD 值显示出收敛结果，其中 IC-LFP 的表现优于原始信号（*p<0.05，对每个 IC-LFP 分别进行 IC 和 LFP 值之间的配对 t 检验，对于 Sch-IC/lm-IC/PP-IC，t = 3.99/2.98/4.59，N = 5）。

为了验证这一发现，我们还直接计算了在不同海马层记录的 LFP 信号中的 CFD。为了与 IC-LFP 进行比较，我们选择了与每个 IC-LFP 贡献最大的位置相匹配的通道中的 LFP 信号（图 5c 和 d）。在str. lacunosum-moleculare和 DG 中的 LFP 中发现了 CFD 的负值，支持伽马振荡对 theta 波相位的驱动作用。我们在 str . radiatum LFP 的情况下找不到明显的方向性，并且在所有情况下，使用 IC-LFP 的 CFD 绝对值都高于 LFP（图 5d），表明源分离工具在研究通路相互作用方面优于使用原始 LFP。总体而言，我们的 CFD 分析表明，支持海马体中伽马振荡的神经回路设定了 θ 范围内主要细胞活动的时间，这反映在记录的 θ 振荡的相位中。

️2.6 θ-γ CFC 和 θ 同步的行为调节

先前的研究表明，CFC 和区域间一致性都与学习独立相关。我们的分析（图 4）现在表明这两种现象似乎是相互关联的。因此，在我们最后一组实验中，我们寻找行为证据来支持以下假设：它们是灵活整合或分离神经元计算的共同机制的一部分。更具体地说，我们假设层特定相互作用将锁相层之间的 θ 振荡，以促进 CA1 中 CA3 介导和 EC 介导的信息流的整合；例如，在学习条件下，需要比较来自记忆（Sch-IC 通路）和来自环境的上下文表征。

一种这样的学习条件是不匹配新奇，其中受试者重新接触先前访问过的已被修改的情境。在比较记忆中的预期表征和在环境中发现的表征时会发生“不匹配”。为了测试在错配新奇过程中 ICPC 和 CFC 是否并行增加，我们训练动物完成一项任务，在该任务中，在习惯于开放场地后（8-10 天内每天一次，每次 8 分钟，图 6a对照），我们在其他不变的场地的地板上引入一种新的触觉刺激（图 6a新奇，见材料和方法）。我们计算并比较了新奇会话和前一天习惯会话之间的 θ 同步和 CFC。当动物进入竞技场时，在探索的前两分钟内，θ 振荡之间的 ICPC 很高，并且在两种条件下相当（图6b，t1）。当动物探索环境时，同步在新奇环境中保持较高水平，但在已知环境中迅速衰减（图 6b，t2）。与信息传输以更新现有记忆的概念一致，在探索时间结束时，当引入的触觉刺激失去新奇性时，两种条件的 θ 同步都降低到相同水平（图 6b ，t3）。作为对照，我们测试了运动活动，比较了新奇和习惯会话之间的运动速度（图 6c），未发现会话之间的差异（p>0.3，t 检验，图 6c）。因此，ICPC 的差异不能仅仅用运动活动的变化来解释。我们使用了像以前一样的多元线性回归分析，现在来研究 θ 功率和频率、实验条件（对照与新奇会话）、任务中的运行速度和时间对测量的 ICPC 的独立贡献（图 6d）。我们发现，θ功率和实验条件是影响ICPC值的主要因素，而运行速度和时间等其他变量的影响则很小。

图 6.在失配新奇期间，局部 θ-γ CFC 和 θ 同步并行增加。( a ) 已知 (左) 和新奇 (右) 开放场环境的示意图。在适应期 (对照) 之后，将动物暴露在熟悉的开放场内的不同地板 (砂纸) 上，提供新的触觉刺激 (新奇)。( b ) 探索过程中三个 IC-LFP 之间的动态 ICPC 的时间演变 (所有受试者的平均值 ± sem)：引入新触觉刺激之前 (蓝色) 和之后 (红色)。两种条件在任务开始时 (t1) 都有最大 ICPC 值，对应于初始探索，随后对照下降，但新奇没有下降 (t2，插图 *p<0.05，配对 t 检验分别比较每个时间段对照与新奇的平均 ICPC，t = 3，N = 5)。两种条件在探索时间结束时 (t3) 都降低到相同的 ICPC 水平。( c ) 对照和新奇期间动物的平均移动速度。两种条件之间没有显著差异（每个时间段的受试者配对 t 检验，N = 4）。彩色线代表每个受试者的值。（d）多元线性回归，其中 θ 功率、θ 频率、速度、会话（控制或新颖性）和时间是导致三个 IC-LFP 之间 ICPC 的独立因素。条形图表示每个因素解释的方差，无法用其他变量来解释。除 Sch-IC 和 lm-IC 中的 θ 频率外，所有贡献都是显著的（见材料和方法）。（e）CFC 计算为新颖性条件下定义时间窗口（t1、t2 和 t3）内的平均 MI 与控制条件中的平均 MI 之比（*p<0.05，受试者配对 t 检验，t2 中的 Sch-IC/lm-IC/PP-IC 为 2.95/5.65/2.92，N = 5）。

然后，我们计算了相同记录中的 CFC 指数 (MI)，发现它与两种条件下整个会话期间的 θ 同步变化相一致，如图6b 和 e所示。在与更高 θ 同步相关的新奇会话期间，三个 IC-LFP 中的 CFC 强度较高，并与 ICPC 并行在会话结束时降低（图 6e）。先前的研究表明，EC 通路中的 CFC 优先发生在动物用后腿站立时，这是对新奇事物的探索性反应，这也与 θ 频率的增加有关。为了研究站立行为对我们在错配新奇任务中的发现的潜在贡献，我们从记录中删除了动物用后腿站立的时期，然后重新分析了 ICPC 和 CFC。如图 6—图补充 1所示，在没有后退时期的情况下，三个 IC-LFP 之间的 θ 同步性在新奇性期间得以维持。同样，MI 在新奇性期间较高，尽管变化更大，这可能反映了去除后退后退后数据样本数量的减少。我们得出结论，在错配新奇性中发现的变化不能仅用后退行为来解释。此外，我们测量了完整时间序列中的 θ 频率，并在对照和新奇性条件下进行了比较，发现 Sch-IC 和 PP-IC θ 频率在 t2 中显著下降（图 6—图补充 2）。

在第二个行为实验中，使用了海马依赖性延迟空间交替任务，其中动物需要记住在前一次试验中访问过的手臂，并使用当前试验中的选择来更新记忆，同样依赖于来自记忆和外部感官线索的背景表征之间的相互作用。大鼠在 8 字形 T 迷宫中学习在连续试验中在左臂或右臂之间交替以获得水奖励（图 7a），直到它们的表现达到 80% 以上。在此任务中，中央臂与记忆回忆、决策和当前决策的编码有关 ，而侧臂中的神经元记录被认为几乎无法传达任何信息来预测下一试验中的行为结果。使用此任务，先前的独立研究表明，在 CA1 和 CA3 锥体层中记录的 θ 振荡之间存在相移，并且与中央臂相关的 CA1辐射和lacunosum-moleculare IC-LFP中的 CFC 增加。因此，在本分析中，我们想要验证我们的假设，即中央臂的 θ-γ CFC 和 θ ICPC 同时增加，并通过将 PP-IC 纳入分析来扩展先前的发现。我们计算并比较了正确试验中从中央臂和侧臂获得的记录中的 θ-γ CFC 和 θ 同步，仅选择两个臂的运动速度相当的那些时期（图 7b）。我们发现三个 IC-LFP 的中央臂 CFC 显著增加（图 7c）。重要的是，与 CFC 同时，我们还发现同一时期中央臂的 θ ICPC 增加（图 7d 和 e）。

图 7.局部 theta-gamma CFC 和 theta 同步并行变化并且与 T 迷宫任务中的决策相关。( a ) T 迷宫任务中的跑步轨迹示例。( b ) 中心和侧臂的平均移动速度（所有受试者的平均值 ± sem）。仅在两种条件下速度相似的试验才被考虑用于分析。( c ) 迷宫中心和两侧的 MI 之间的比率（*p<0.05，受试者配对 t 检验，对每只动物的所有选定试验取平均值，Sch-IC/lm-IC/PP-IC 的 t = 3.61/4.03/3.54，N = 4）。( d ) 中心和侧臂的 ICPC 值显示三个 IC-LFP 之间的同步（*p<0.05，组级配对 t 检验，t = 4.79，N = 4）。使用所有正确试验的配对 t 检验得出受试者内的差异（彩色线）（黄线：p < 0.0001，N = 114 次试验；紫色：p < 0.05，N = 63；绿色：p < 0.001，N = 151；蓝色：p = 0.07，N = 69）。（e）一次试验中不同位置的 ICPC 值的代表性示例。

因此，这两项行为任务的结果表明，跨生成器的 θ-γ CFC 和 θ ICPC 是关联的，并且优先发生在记忆引导探索和不匹配新颖性检测期间，在这两种情况下，内部生成的记忆表征需要与传入的有关外部线索的感官信息相结合。它们支持以下观点：不同的 θ-γ 框架可以灵活地协调海马体中的信息传递。

️ 三、讨论

总体而言，我们的研究结果提供了支持海马中独立 θ 振荡的功能证据，其协调可看作是在海马层之间传递信息的机制。同步的 θ 状态可能绑定分布式计算，而不太同步的 θ 状态可能确保局部电路中相对独立的处理（隔离）。协调 θ 框架的机制可能是什么？我们表明，跨海马层的 θ 相位锁定与更强的 CFC 相关。此外，方向性分析表明，波段和通路特异性伽马活动始终先于 θ 波，可能有助于跨层同步 θ 振荡。因此，我们假设 CFC 反映了一种由局部兴奋-抑制相互作用操作的机制，以协调分离的 θ 框架中的神经元计算。在具有多个连接节点的网络中，特定节点之间的 θ 相位锁定将进一步促进信息流的方向性，在定义的时间窗口中允许或阻止通信的目标。我们通过证明 CFC 和海马中记录的 θ 电流发生器之间的协调在记忆过程中增加，提供了支持这一假设的证据。

️3.1 独立 Theta 框架

在本研究中，我们使用基于独立成分分析的空间鉴别技术分离了由不同突触通路贡献的 LFP 源。与原始 LFP 或 CSD相比，这一处理步骤使我们能够更可靠地表示局部电生理动力学。LFP的主要缺点是信号的多源来源，即偶极（或四极）场电位的混合。虽然多源原始 LFP 的 CSD 避免了体积传导问题，但它不会分离记录区域中的共同激活电流源，因此针对相同细胞（例如 CA1 锥体细胞）的通路的 CSD 会重叠并相加/相减，从而相互抵消。在这些情况下，CSD 的时间过程是一个复合过程（因为它是原生 LFP 的时间过程），并且不能明确地分配给任何共同激活源。因此，源分离技术对于获得每个单独突触贡献的正确时间过程是必不可少的。

大量先前研究表明海马和 EC 中存在多种 θ 节律和电流发生器。虽然隔膜活动是 θ 节律所必需的，并且针对内侧隔膜的损伤会消除这两个结构中的 θ 振荡，但来自 CA3 的内在海马活动和外部 EC 输入也对记录的 θ 振荡有所贡献。手术切除 EC 会揭示一种依赖于 CA3 完整性的 θ 振荡，并且在海马各层之间具有高度一致性。然而，在存在完整的 EC 的情况下，放射层和分子腔隙层中的 θ 信号之间的一致性会降低，与 CA3 和 EC3 之间的输入竞争一致。现在，使用针对 CA3 PV+ 中间神经元的光遗传学工具（图 2），我们提供了新的结果，通过展示 CA3 相关的 Sch-IC与EC 相关的 θ 发生器（lm-IC 和 PP-IC）的特定调制，最终支持海马中独立 θ 振荡共存。此外，每个发生器中 θ 功率和频率的变化都是动态且独立发生的（图 4）。尽管如此，已识别的 θ 框架之间的相移有助于在亚秒时间尺度上成对或三元组协调它们（图 2和图 2—图补充 1）。反过来，我们推测，这些海马 θ 耦合状态将与不同的全脑网络状态相关。为了支持这一观点，我们发现选择性行为/认知功能与不同框架间 θ 同步状态相关（图 6和7）。最后，在单个通路特异性 LFP 中观察到的 θ 频率动态变化（图 4和图 6-图补充 2）也反驳了将已识别的 θ 框架视为由外部起搏器驱动的单片振荡的观点，而是表明弱耦合局部振荡器和全局节律发生器的协作可以对 θ 振荡进行微调。因此，海马中的 θ 活动既不是唯一的，也不是单一的。

总体而言，如果将脑振荡视为神经元兴奋性的节律性变化，则可以定义连续的信息包，那么海马体中发现的 θ 同步的动态变化可能反映了多个 θ 协调的时间框架，振荡之间的相位差对各个层中神经元放电的时间有很大影响。θ 框架的同步反过来会协调（尽管不一定同步）连续海马站的放电序列。由此生成的处理流可以传输独立信息，例如由记忆检索或外部环境线索驱动的信息，或整合/比较两个信息源的结果，具体取决于认知需求。

️3.2 θ-γ相互作用

θ 振荡相位与伽马活动幅度之间的相互作用已得到广泛研究，并被认为是整合不同空间和时间尺度活动的有效机制。我们的分析表明，海马中 θ 和 γ 振荡之间的相位-幅度 CFC 对 θ 框架具有选择性（图 3）。当使用 IC-LFP θ 振荡作为相应层特定 γ 活动的时间参考时，θ 和 γ 之间的相互作用更高，而不是像通常那样使用单个 LFP 记录。这一观察结果与先前的重要证据一起证明，CA3 和 EC3 中主细胞的放电与 CA1放射层和分子层中记录的下游 theta 嵌套伽马振荡相位锁定，这表明局部层特定回路与上游传入通路相互作用，在多个 theta-gamma 框架中组织海马细胞组合。

我们在研究中发现 CFC 强度和 theta 同步之间显著的正相关（图 4），进一步表明层特定 CFC 可能反映了 theta 框架协调的机制。γ 振幅和 theta 相位的共同调节可能是由于 theta 驱动的过程增加了 γ 活动、γ 驱动的 theta 相位调制，或者由于同时存在对快和慢两个成分的共同外部驱动。CFD 指数此前已被证明可以在建模数据和真实电生理记录中揭示快到慢和慢到快的频率相互作用。我们首次将其应用于海马 IC-LFP，并且与该领域的普遍假设相反，揭示了主要的 γ-theta 相互作用（图 5）。这种方向性直接在 LFP 信号上得到证实（图 5），尽管不能完全排除同时控制两个节律的第三个输入的贡献。我们不认为这个结果说明海马中的 θ 振荡是由 γ 活动引起的。相反，我们认为 γ 活动反映了抑制-兴奋网络的相互作用，它对相应层中正在进行的 θ 振荡施加了相移。因此，由来自各自上游层的传入神经元驱动的局部伽马生成电路可能不会在特定的 θ 相位被激活，而是协调主细胞活动并设置局部 θ 振荡的相位。

虽然分析支持上述 gamma-theta 相互作用的精确电路机制超出了本研究的范围，但存在几种可能性。计算工作表明，theta-gamma CFC 源自功能不同的中间神经元群体之间的相互作用，这些中间神经元群体在接收外部 theta 节律发生器（例如隔膜输入）的主细胞网络中相互连接，有趣的是，最近的研究结果表明，在 CA1 区域，一些中间神经元可以专门锁定慢伽马，而另一些则可以锁定中伽马，这支持了不同类别的中间神经元驱动慢伽马和中伽马振荡的观点。因此，一种有吸引力的伽马调制 θ 相机制是通过通路特异性输入控制不同类型的中间神经元，这将诱发特定的伽马网络，调节主细胞的兴奋性并响应正在进行的 θ 输入而激发，从而提前或延迟 θ 相。为了支持这一假设，最近对 θ 周期基础上的 θ-γ 关联的分析表明，在 θ 波段，中间神经元的尖峰场相位同步性明显高于锥体细胞。最后，主细胞中的尖峰共振也可能有助于这种机制，因为海马和新皮质中篮状中间神经元（PV 细胞）的光遗传学激活会通过 I h活动的抑制后反弹来调节 θ 范围内锥体细胞的放电。在该实验中，兴奋性神经元的 θ 波段放电需要抑制性篮状细胞的节律性激活，因为白噪声激活有效地调节了它们的活动，但并没有诱导锥体 θ 波段放电。因此，共振放大需要来自上游层的中间神经元的前馈激活或外部节律输入（即来自隔膜的胆碱能或 GABA 能输入）。因此，内在细胞特性和网络机制可能相互作用，以支持跨海马层对 θ 相的伽马依赖性协调。

上述解释也解释了 CA1 θ 和 CA1 慢伽马和中伽马之间的相位-相位耦合，这是由 CA3 和 EC3 中的上游输入分别引起的通路特异性伽马活动驱动的 θ 相位的结果。然而，最近的研究强调了频率谐波和波形不对称在测量相位-相位耦合以及振幅-相位 CFC时的重要性。振荡活动中的波形不对称会引入无法仅由正弦分量定义的光谱内容，因此可能导致虚假的 CFC 和 CFD。已经开发出多种方法来克服这些限制，从而改进了对 θ 相位的估计并最大限度地减少了尖锐边缘的影响。我们在分析中应用了这些方法（材料和方法）。振荡的特定波形不应被视为问题，而应在适当考虑时视为生理信息的来源。

️3.3 并行处理、分离和集成

所提出的场景提供了一种机制，通过 θ-γ CFC 同步 θ 振荡，协调以 θ 波组织的分布式计算。我们推断，当需要整合 CA3 和 EC 相关信息流时，层特定相互作用将锁定层之间的 θ 振荡。我们选择了两个众所周知的行为任务来检验这一假设。我们首先使用了不匹配新奇任务，其中将涉及 CA3 相关通路的背景记忆表征与 EC 相关通路（传递到 CA1 和 DG）传递的新的（不匹配）感觉输入进行比较。我们的假设预测，在新奇条件下，三个 θ-γ 框架中的 CFC 和 θ 同步应该同时增加，这是我们通过实验发现的（图 6）。这一结果无法仅用动物的速度来解释，因为在我们的实验中，动物在已知条件和新奇条件之间无法区分速度，也无法用有时与新奇探索相关的后退行为来解释。在校正跑步速度后，在 8 字形 T 迷宫的中央臂也发现了 CFC 与 theta 同步之间的联系（图 7），该位置是记忆中的情境表征与外部感官线索之间的相互作用，用于决策和编码。这些结果整合了先前的独立研究结果，证明了 CA1 和 CA3 锥体层中记录的 θ 振荡之间的相移以及与中央臂相关的 CA1辐射和lacunosum-moleculare IC-LFP 中的 CFC 增加。

最近一项使用未知新颖性测试的研究表明，θ-γ CFC 仅在 EC 通路中增加，但在 CA3 通路中没有增加。重要的是，与失配新颖性相比，未知新颖性涉及接触以前未访问过的环境，因此缺乏记忆表征。因此，在缺乏记忆表征的情况下，只有传达环境线索信息的 EC 通路才会表现出增强的 θ-γ 耦合，这支持了我们的假设。最后，我们发现在 Sch-IC 和 PP-IC 中的失配新颖性条件下 θ 频率降低 (图 6 — 图补充 2；Wells 等人，2013 年)，而据报道在未知新颖性中的 EC 通路中 θ 频率增加，这表明在失配新颖性期间需要 θ 频率调制来耦合三个 θ 框架。

最近的重要研究以周期性的方式研究了 theta 振荡，表明与不同行为相关的频谱分量和 theta-gamma 相互作用发生了高度动态的变化。这些研究支持以下观点：单个 theta 周期代表灵活的时间单位，可以暂时组织 CA1 计算。我们发现海马体中共存的层特定 theta 振荡会动态耦合和解耦，我们认为这分别反映了一种整合或分离计算的机制。这种可能性与之前基于在 theta 波相位中计算分离的可能性或如上所述的单个 theta 周期中计算分离的可能性有着根本的不同，因为那些都是基于在相位或周期之间快速交替计算模式，但始终基于独特的 theta 框架。相反，我们的新建议考虑在接收来自不同 theta 框架的信息的细胞组件中进行并行处理。theta 振荡之间一致性的降低会解耦处理流，从而将底层的认知过程（即检索与编码）分开。一致性的增加反而会将它们耦合起来，从而促进 CA1 神经元和两个信息流的下游区域的整合（即当需要比较存储和正在进行的上下文信息时）。然而有趣的是，这两个模型是互补的，因为每个 theta 框架中的计算可能会以周期性的方式变化，这代表了一个更加通用的编码框架。

️ 四、材料和方法

️4.1 动物和手术

五只体重 250–300 克的雄性 Long-Evans 大鼠接受不同行为任务的训练，使用多通道电极记录海马的电生理活动。样本量根据先前在 T-Maze 任务中分析海马 theta 和/或 gamma 的报道进行选择。所有大鼠均植入 32 通道硅探头，并依次连接到由两个相应连接器组成的跳线，跳线由 5 cm 长的柔性电缆连接。将 Ag/AgCl 线（美国佛罗里达州世界精密仪器公司）电极与手术区域两侧的皮肤接触，并用作接地。数据以 5 kHz 采集，模拟高通滤波器为 0.5 Hz。数字化后，我们首先以 300 Hz 进行低通滤波，使用 50 Hz 和 100 Hz 的陷波滤波器消除净噪声，并以 2.5 kHz 的频率对信号进行下采样。我们以齿状回的典型诱发电位为参考，调整了两个电极的最终位置，以便记录齿状回中的最大群体峰值。

手术后，大鼠至少要留置 10 天，直到完全康复。在最初的 72 小时内，每天两次皮下注射止痛药（丁丙诺啡，剂量 2-5 μg/kg）。在 1 周内，还给大鼠注射溶解在水中的抗生素（恩诺沙星，剂量 10 mg/kg）。直到动物对植入物的操作没有表现出不适的迹象时，才开始行为任务。

️4.2 数据采集

所有受试者在手术前都按照下一个方案进行了训练。前三天包括在空旷的场地进行每天两次 10 分钟的适应过程，大鼠可以自由活动。环境是一个 50×50 厘米的甲基丙烯酸酯沙箱，顶部打开，三面墙上有三个视觉提示。之后，他们每天进行两次新的训练，持续 8 天，首先重复适应过程，然后执行之前描述过的改良 T 迷宫任务。它由几条 8 字形的轨道组成（长/宽/高分别为 132/102/80 厘米，轨道宽 8 厘米，图 6e）。起点位于中央轨道的起点（图 6e，开始），强迫大鼠跑过那条臂（图 6e，中心），用黑色面板挡住其他路径。在跑道的尽头，它必须选择 T 型路口的两个方向之一，如果成功的试验，拐角处会滴上一小滴水（图 6e，奖励）。如果大鼠选择与前一次试验相反的方向，并总能在 T 型路口后的拐角处找到奖励，则每次重复均视为成功。然后，位于水后面的另一块面板阻止大鼠返回其路线，迫使它穿过相应侧臂到达起点（图 6e，侧面），进行新的试验。每次试验持续 20 分钟，进行大约 30 次试验，所有受试者在最后一次试验中的表现都超过 80%。只有正确的试验才会被考虑进行进一步分析。

手术和恢复后，我们重复了相同的方案8天。为了进一步的电生理分析，我们只考虑受试者保持高水平表现（80％）而没有任何干扰的那些会话。总共有4个受试者的2到5个会话。在第9天，我们进行了“新奇”测试。通过将大鼠引入位于熟悉的开放场内的“新奇室”中，使大鼠接触新奇事物；该室是一个透明的甲基丙烯酸酯盒，底座为方形，宽35厘米，高40厘米，顶部开口，地板上铺有砂纸以提供明显的触觉刺激。此后，移除新奇室，将动物留在开放场中再10分钟，将此会话视为分析的控制条件。

除图 6中的结果外，所有分析都是在控制会话（最后一次会话）期间进行的，可以在熟悉的环境中自由移动。

️4.3 光遗传学实验

我们在设施内饲养了四只雄性 Long-Evans 转基因大鼠，这些大鼠在大鼠小清蛋白启动子下表达 Cre 重组酶，成对饲养，随意提供食物和水，并维持在 12/12 小时明暗循环下。

️4.4 病毒注射和手术

手术中，大鼠用异氟烷麻醉（4.5% 诱导，1–2% 维持，0.8 l/min O 2），并通过皮下注射布比卡因（0.2 ml）进行局部麻醉。第一次手术时，所有大鼠体重为 300–330 克。使用连接到输液泵的汉密尔顿注射器（每半球 1 µl，1 µl/min）在背部 CA3 双侧注射 Cre 依赖性病毒载体 AAV1-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-eYFP-WPRE-hGH（Penn Vector Core）（AP -3.5 mm，LM ± 3.6 mm 距离前囟和 DV -2.8 mm 距离大脑表面）。因此，ChR2 在 PV+ 细胞（PV-ChR2）中特异性表达。

病毒注射两周后，大鼠接受第二次手术，植入两个光纤插管和一个记录电极。首先，将五颗螺钉固定在头骨上，以加强植入物的固定。与之前的大鼠组一样，将连接到跳线的 32 通道硅探针放置在覆盖背侧 CA1 和 DG 的左海马中。参考线连接到其中一个螺钉上。电极植入的坐标为 AP -3.5 毫米、LM ± 2.5 毫米（距前囟）和 DV -3.0 毫米（距大脑表面），但其最终位置是根据刺激穿通通路引起的电生理电位进行调整的。然后，将光纤插管（直径 200 µm、NA 0.66、长度 10 mm）放置在两个半球背侧 CA3 处，在冠状面上呈 20° 角，坐标为 AP −3.5 mm、距前囟 LM ± 5.2 mm 和距大脑表面 DV –3.2 mm（图 2a）。将电极和两根光纤定位后，取出刺激电极，并涂抹几层牙科水泥以确保所有组件充分固定。术后护理与之前的大鼠组相同（见上文）。其中一名受试者在手术后和任何分析之前被排除在实验之外，原因是其电生理记录质量下降。

️4.5 动物行为的光遗传学操作和数据采集

所有行为程序均在黑暗周期内进行。在植入手术后完全恢复后，在开始实验之前，我们对动物进行了 5 天的处理，以让它们习惯实验者以及植入物的操作（连接头台和光纤跳线）。

连续 5 天，大鼠在已知的开放场地（50 × 50 × 40 厘米的黑色丙烯酸酯盒）中进行每天 8 分钟的训练，地面铺有垫料。每次训练时，动物都可以自由探索场地，同时接受光刺激的开/关周期。激发 ChR2 的光由波长为 460 nm 的蓝色 LED 光源以 50 mW/mm 2 的功率发射。整个训练期间的刺激方案包括 5 秒 40 Hz 序列，每 30 秒 1 毫秒的光脉冲。

对于双侧刺激，我们使用了一根分支光纤跳线（直径 500 µm，NA 0.63），该跳线连接到旋转接头，而旋转接头又通过光纤跳线（直径 1 mm，NA 0.63；Doric Lenses）连接到 LED 光源。每次治疗前，使用功率计测量传输光的功率密度，以确保所有治疗中的功率密度相同（50 mW/mm 2）。

光脉冲由刺激发生器触发，由 MC_Stimulus 软件控制。使用开源采集系统（Open Ephys）以 5 kHz 采样率记录电生理数据，并使用 I/O 板（Open Ephys）与光刺激和视频录制同步。

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️4.6 免疫组织化学分析

实验结束后，用 4% PFA 对大鼠进行心脏内灌注。将大脑在室温下固定 3 小时，然后储存在 PBS 中，温度为 4°C，过夜。然后，将大脑切成 50µm 的薄片，以证实病毒感染以及记录电极和光纤套管的正确位置。将切片与小鼠产生的单克隆 PV 抗体（1:2000）一起孵育，然后用山羊产生的抗鼠二抗（1:500，Alexa Fluor 594 染料）孵育。完成组织学处理后，使用荧光显微镜与 Neurolucida 软件对大脑切片进行成像，并使用 Image J 软件对图像进行处理。

️4.7 视频录制和追踪

在所有任务期间，动物都受到监控，并使用位于房间顶部的标准摄像机记录它们的行为。使用这些视频，使用软件跟踪器跟踪受试者的位置，以它们的质心为参考点。视频和电生理记录的同步是通过触发红色 LED 并将其在记录中留下的时间标记与第一帧光相匹配来实现的。

️4.8 LFP 的电流源密度分析

获取 LFP 贡献源信息的第一个方法是使用 CSD 分析。它测量跨膜电流，提供局部汇和源（分别为内向和外向电流）的时空分布。与 LFP 相反，这些电流代表空间局部现象，从而提高了空间分辨率。

膜电流可以按照拉普拉斯方程并使用测量的场电位和介质的电导率来实现。由于海马是分层结构，因此采用了与记录电极平行方向的一维方法：

我们假设整个结构为各向同性、均匀的介质。虽然海马层呈现出不同的电阻率，但它们对特定位置的时间动态影响不大。因此，距离和电导率是常数，它们仅充当比例因子。在本研究中，接触点之间的距离为时长= 100 μm，假设电导率恒定σ = 350 Ω −1 cm −1。

尽管 CSD 比 LFP 具有更高的空间分辨率，但它无法区分不同通路的贡献。不同来源的多个膜电流可能在时空上重叠，局部电流也会受到附近域活动的影响。为了克服这些限制，我们应用了独立成分分析 (ICA)。

️4.9 LFP 的独立成分分析

诸如 CSD 分析之类的方法可以通过消除传播场电位（见上文）来分离局部跨膜电流。然而，不同的途径对这些电流有贡献，并且它们的活动可能在时空上重叠。为了解开产生 LFP 的具体来源，我们应用了 ICA。

该方法的有效性已在海马体中得到充分研究和证实。该方法旨在解决分离混合在 M 个输出通道中的 N 个统计上独立的源的问题。为此，它执行模式盲分离，因为源的不同分布是未知的。此外，它假设源在空间上不动，或者换句话说，轴突终端的位置固定。它们的突触电流对 LFP 的贡献使不同的独立成分 (IC) 或生成器符合解开。

由于具有显著方差的 IC 数量通常较少（32 个中只有 4-7 个），我们事先使用主成分分析对载荷矩阵进行了降维，保留了原始 LFP 方差的 99%。对于每个结构和电图状态，最佳成分的数量通过逐步增加主成分的数量来确定，直到新的 IC 仅为噪声。由于噪声成分贡献的方差可以忽略不计（在信号中没有伪影的情况下），我们始终选择这个数字加二。有多种算法可以计算将 LFP 数据转换为 IC 的混合矩阵，尽管如此，它们都共享一个共同的理论框架。在本研究中，我们使用了信息最大化方法 RUNICA，该方法在 matlab 工具箱“ICAofLFPs”中实现。为了进行比较，还计算了核密度 ICA 算法 KDICA，得到了类似的结果。

根据定义，ICA 可以提取与 LFP 信号一样多的发生器。为了正确识别 IC 的突触前特异性，必须考虑几个条件。首先，每个 IC 对 LFP 的总方差（功率）的贡献不同。只有那些贡献显著（在本研究中 > 1%）的 IC 才会被考虑进行进一步分析。其次，每个发生器的解剖结构在每个受试者中都是固定的。换句话说，每个 IC 的空间分布必须随时间保持稳定。这是通过在不同的短期时期应用 ICA 来评估的。只有在所有条件下都存在且具有稳定空间负荷的组件才可能代表真正的电流发生器。此外，受试者之间应该存在一定程度的相似性，并且特定通路在不同动物中应该具有可比较的分布。第三，通过用阈下诱发活动刺激各自的兴奋通路来确定每个发生器的突触特异性。第四，并非每个突触输入都会在 LFP 中留下足迹。该区域的几何形状以及轴突和树突的分布决定了每条通路对场电位的实际贡献。这需要特定的现实模型来测试测量电流的多种来源。

在我们的数据记录中应用 ICA 并考虑上述所有条件，我们能够在所有受试者中提取三个常见且稳定的生成器（图 1和图 1—图补充 1）。它们对应于海马的通路特异性输入。其中两个在 CA1 中：一个在str. radiatum中，对应于从 CA3 到 CA1 中锥体细胞的 Schaffer 侧支的突触末端（Sch-IC）；另一个成分在str. radiatum 中有一个电流接收器。lacunosum-moleculare (lm-IC)，从 EC3 到 CA1 中锥体细胞的输入位于此处。在 DG 中发现了第三个成分，它对应于通过穿通途径从 EC 层 II (EC2) 投射到颗粒细胞树突的轴突（PP-IC）。请注意，PP-IC 的活跃突触域位于 DG 的分子层，但其场电位在门部区域占主导地位（图 1）。这是由细胞膜向分子层的体积传导产生的。门上方和下方常见电流的场电位在此区域重叠，从而增强了它们的电场。

提取的 IC 代表通向海马的特定通路的电流源。因此，每个发生器的时间动态和节律反映了附近不同区域产生的活动（Sch-IC、lm-IC 和 PP-IC 分别为 CA3、EC3 和 EC2）。这种方法的一个局限性是它不能分离同一起源（即 theta 和 gamma 振荡）内的不同时间模式。这是两个主要影响的结果。首先，同一个神经元可以以多种模式激发。此外，来自同一区域的突触终端产生的电流在空间上完全重叠，它们的组合构成一个发生器。此时应该注意，ICA 需要空间和时间的独立性。因此，两个具有完全相同时间动态的空间分离源将汇聚在一个组件中。尽管如此，信号共变的微小差异（即时间抖动和/或不完美的振幅共变）将允许正确分离两个源，即使它们之间存在高度的一致性。

另一个考虑因素是，最强大的发电机可能会将污染引入其他组件。为了确保巨大的 theta 功率不会影响 IC 的鉴别，我们通过以 30 Hz 滤波原始 LFP（分别在 <30 Hz 时使用低通，在 >30 Hz 时使用高通）来分离慢节奏和快节奏的 LFP。将 ICA 分别应用于每个过滤后的数据集。我们将得到的 IC 与使用未过滤数据的 IC 进行了比较，确认在所有条件下都发现了相同的发电机，并且时间序列非常相似（图 1—图补充 1）。

ICA 不能确保每个发生器的极性和幅度正确。但是，由于 ICA 算法是可逆的，因此可以单独检索每个组件生成的 LFP。可以将 CSD 应用于这些重建信号，从而获得每个特定通路的接收器和源。这样的部分信号确实具有正确的极性和幅度。

️4.10 时间序列的预处理和功率分析

经过 ICA 算法计算后，每个受试者对应的数据集由三个时间序列组成。这些信号以 625 Hz 下采样以提高计算分析速度。它们还进行了标准化，为每个数据集分别施加了零平均值和一标准差。这样，我们增加了受试者之间的相似性并促进了它们的比较。

使用多锥法估算功率谱。对于特定频带的功率分析，我们使用了基于滤波和希尔伯特变换的方法。首先，在感兴趣的频率之间用 FIR 滤波器对信号进行带通滤波。然后，我们计算希尔伯特变换，并将瞬时功率估算为每个时间点的信号平方复模量。平均值是特定时间窗口内的平均功率。我们定义了文本中使用的以下频带（除非另有说明）：delta（1-4 Hz）、theta（6-10 Hz）、慢伽马（30-60 Hz）、中伽马（60-100 Hz）和快速伽马（100-150 Hz）。

使用相干性分析评估每个特定频率下 IC-LFP 之间的线性相互作用。它测量交叉功率谱密度与其各自功率谱密度之间的比率，并使用 Matlab 中的 mscohere.m 函数计算。统计显著性通过替代分析确定（本研究中有 1000 个替代）。使用这种方法，通过随机将一个信号相对于另一个信号移动来破坏信号之间的时间关系。然后，将每个频率下的相干性替代结果近似为高斯分布，显著性阈值是先前累积分布为 0.95（p=0.05）的值。

为了评估伽马活动沿θ相位的分布，首先在感兴趣的频率（伽马和θ）下过滤信号，并使用希尔伯特变换提取振幅和相位。然后，对于每个θ周期，将伽马活动的包络分为 N 个等距区间；然后对所有周期取平均值。与相干性分析类似，通过替代分析（1000 个替代项）评估统计显著性，随机将伽马信号相对于θ相位移动。通过对所有模拟结果取平均值来估计替代分布。

️4.11 检测θ节律

从整个记录中，只有那些在所有成分中具有真实 θ 节律的时期才会被考虑进行进一步分析，即在该波段具有高功率的时期。此外，由于振幅较小的振荡可能导致对其相位的估计不太准确，因此我们仅选择那些具有最小 θ 功率值的周期以避免此问题。为了找到这样的阈值，我们将 θ 节律数据建模为 θ 振荡的组合

噪声是使用Matlab 中的pinknoise函数计算的，而十θ（吨）

段或周期定义为：

我们可以完美地估计出θ节律的相位，这就是基本事实。简而言之，对于每次模拟，我们通过改变一个参数，我们估计了 theta 振荡的相位（见下文）。这样，我们能够测量我们的估计值与地面真相之间的误差，作为相对 theta 功率的函数，然后找到最小化该误差的值。这些步骤的详细描述如下。

对于每个数据集，我们在 delta（1-4 Hz）和 theta（6-10 Hz）频率下对每个信号进行带通滤波。然后，我们计算希尔伯特变换，并将瞬时功率估计为每个时间点信号复模的平方。相对 theta 功率是平均 theta 与 delta 功率之比。通过希尔伯特估计了经过 theta 滤波的信号的振荡相位，分别为零和 π 弧度，分别对应于周期的波谷和波峰。最后，将误差测量为实际相位的每个波谷与估计波谷之间的平均距离（以毫秒为单位）。此外，我们计算了最小误差，即十n（吨）设置为零。该值对应于用于估计相位的方法引入的噪声，与功率无关。比率与误差之间的关系如图1—图补充 3所示。

使用模拟数据，我们认为，当振幅误差（即不考虑滤波引入的误差）低于 1 毫秒时，θ 功率不会影响 θ 相位的估计。这相当于 θ 功率比 delta 高 3.78 倍（为简单起见，我们取 4 倍）（图 1-图补充 3）。在实际记录中，我们不仅预计会有神经噪声，还会预计会有 delta 带的活动。因此，通过该程序获得的理论阈值代表保守测量。对于那些 delta 活动较高的情况，随着比率的降低，阈值会更加严格，但 θ 功率始终足够高，以保证正确估计相位。

为了检测所有记录的 IC 中的 θ 节律，我们使用了一个 θ 周期（约 125 毫秒）的滑动窗口，并仅选择 θ 功率与 delta 之比（按上述方法计算）高于 4 的时期。此外，为了进行比较，还对取阈值 6 和 8 进行了分析，结果显示没有显著差异。

️4.12 光遗传学调节通路特异性θ活动

在表达 Cre 的转基因受试者中，我们分析了 CA3 PV 中间神经元的光刺激是否只对 Schaffer 侧支 θ 输出产生影响。我们将刺激后立即两秒的时间窗口与刺激的前两秒进行了比较。选择此时间段是为了尽量减少窗口之间不同运动活动的影响。对于所有试验，仅进一步考虑那些具有 θ 振荡（见上文）的试验。然后，我们使用多锥度方法计算了每个 IC-LFP 的功率谱。

️4.13 周期间相位聚类

为了估计 IC 之间的相对 θ 相位，我们使用了改进的试验间相位聚类方法来解释周期之间的差异，而不是试验之间的差异（ICPC）。在这种方法中，每个试验被定义为一个模数为 1 的向量，其角度对应于在特定时间点测量的振荡相位（φt ）。然后，ICPC 被计算为所有试验中平均向量的模数：

如果角度分布沿极轴均匀，则 ICPC 值为零。相反，接近 1 的值表示分布中的首选相位，即所有试验都具有相同相位。

为了进行图 1h中的分析，我们按照研究人员的方法提取了每个信号的相位，以更好地表征 θ 节律的形状。在 CA1 的锥体层 (pyr. CA1) 中测得的 LFP 被视为参考，其波谷和波峰分别与 0 和 π 弧度重合。我们分别计算了不同成分的 ICPC，其中每次试验都是在 pyr. CA1 的每个波谷处测得的 IC 的相位。因此，试验次数对应于 pyr. CA1 中的 θ 循环数，而 ICPC 的角度和值可以分别解释为 IC 相对于 pyr. CA1 的相位差和稳定性。

通过替代分析（本研究中有 1000 个替代分析）评估统计显著性，随机移动 IC 的相位并保持 pyr. CA1 不变。对于每个模拟数据集，计算 ICPC，将所有替代结果拟合成正态分布。然后，获得与 IC 的 ICPC 相关的 p 值，即 1 减去在 ICPC 值处评估的先前正态累积分布。

️4.14 使用 ICPC 进行逐周期同步

使用 ICPC 方法，可以分别估计每个周期的 θ 节律之间的相干程度。通过此过程，可以动态测量同步性，从而识别高相干性和低相干性的时间段。考虑两个 IC，其中一个作为参考，仅使用三个周期计算每个 θ 周期的 ICPC 值，这三个周期对应于该周期以及前一个和连续周期的相对相位 (图 2—图补充 1 )。如果波高度相干，那么它们的相位沿着 θ 周期会相似，从而导致 ICPC 值接近 1；对于具有不同相位的波，ICPC 会更低。在这项工作中，我们将 lm-IC 中的 θ 振荡视为计算 ICPC 的参考，因为它在该频率下具有最高振幅。此外，信号对（即 lm-IC 与 Sch-IC 和 lm-IC 与 PP-IC）之间的 ICPC 被平均，作为每个时间时期网络全局同步的近似值。

瞬时 ICPC 可与频率或功率等其他指标进行比较，分析同步状态与信号特征之间的相关性。为了计算每个相关性，根据 ICPC 将数据分为 10 组，有 10 个等距箱，范围从 0.75 到 1。我们选择这些值是因为它们包含所有受试者至少 90% 的周期，每个箱 80 个周期（大约 10 秒）。然后，计算每个组不同指标的平均值，分析平均值与 ICPC 值之间的相关性。为了可靠地识别关系，我们比较了得到的相关值（ρ）是否高于替代分析获得的值。每个模拟数据集（本研究中为 100 个替代数据集）都是通过随机移动 IC 组件构建的，打破它们之间的任何时间关系。然后，计算 ICPC 与其他感兴趣的特征之间的相关性，将结果拟合为高斯分布。如果相关性值高于替代分布的第95 个百分位数，我们认为相关性是显著的。

️4.15 多元线性回归

使用多元线性回归对作为 ICPC 预测因子的几个特征进行联合分析。首先，我们对与每个特征相关的所有值进行排序（matlab 中的 tiedrank.m 函数），以最小化数据集中外层的影响。然后，使用每个预测因子乘以一个 beta 因子来拟合单个模型：

通过拟合不包含该预测因子的简化多元线性回归并计算完整模型中的方差减去简化后的方差，可以估计一个特定预测因子对模型总解释方差的贡献。

为了估计每个变量是否对受试者的 ICPC 有显著贡献，我们遵循研究人员研究，并测试了它们相关的 beta 值与零之间的统计差异（t 检验，Bonferroni 校正）。

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